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标题:【求助】Real-Time 扩增效率和倍比稀释问题

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发表于 2015-11-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Real-Time 扩增效率和倍比稀释问题


大家好！我开始做荧光定量PCR已经三个月了，才发现自己走了很大的弯路。不知道要使用相对定量应该先测一下内参和目的基因的扩增效率是否一致，再选用双delta Ct法或双标准曲线法。
现在掉头回来开始cDNA倍比稀释，稀释比例为1：4，发现总是做不好，内参的扩增效率总是30％－40％，头都大了，老板那里我实在没脸见了，各位大侠救命！
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发表于 2015-11-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先看看你的内参是不是特异性的。
扩增效率不好通常有两种原因：第一体系没有优化好，第二就是你的引物设计有问题，有非特异性扩增。
注意：有些情况下，非特异扩增用电泳是都看不出来的。可以用SYBR做一个溶解曲线试试。如果条件不允许，那就跑个50ul体系的PCR，然后全点了，看看。
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发表于 2015-11-10 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢您！我做的是microRNA，逆转时用的RNA量是500纳克（10微升体系）然后将cDNA五倍稀释做PCR，现在的倍比稀释是在五倍稀释的基础上做的。是不是模板太稀了，我应该加大模板吗？
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发表于 2015-11-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问扩增效率怎么计算呢？我做相对荧光定量一直就没做标准曲线，光看溶解曲线保持单峰和CT值在20-30范围了。是不是做相对荧光定量之前先必须做目的基因和内参的标准曲线啊？
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发表于 2015-11-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我目前的理解是这样的，如果效率一样，就可以用双deltaCt法，不一样的话，就得用双标准曲线法。扩增效率软件会根据标准曲线的斜率给出，一般斜率为-3.3时，效率约为100%。这是最理想的状态。如果内参的扩增效率和目的基因的扩增效率相差超过5%，可能就算不一致了吧。
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发表于 2015-11-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦，谢谢！你是在哪看到的啊，有相关的文献或是说明吗？我们这边做相对定量都不看目的基因和内参的扩增效率呢，有因为内参太亮后来上相对荧光定量时就把内参模板稀释很大倍数的，而目的基因不变，这样做出来的数据是不是很不可靠呢？要是能这样的话是不是你也可以把内参和目的基因稀释不同的倍数呢？我刚开始做这个不怎么懂，不知道这样对不对？
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发表于 2015-11-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，我只是个菜鸟，这几天为这件事快烦死了，我说的只是在园子里零零星星看到的一点，也不知道对不对，我也得向大家讨教。
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发表于 2015-11-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般扩增效率不会低到30%-40%,是不是你的计算方法不准确.
一般采用10倍稀释法时, 标准曲线的斜率为-3.33最好,但你用的是1:4稀释,就不能叫做是倍比稀释,1:2才是倍比. 如果你1:2稀释, 扩增曲线的Ct值相差应该是1
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发表于 2015-11-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

计算结果是计算机自动给出的，不是我计算的。1:4稀释不就是Ct相差2吗？
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发表于 2015-11-10 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是扩增效率正常有一个范围，低到30%－40%就属于不正常了？
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