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标题:【求助】荧光定量PCR空白对照NTC只加引物不加...

mickeylin[使用道具]
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【求助】荧光定量PCR空白对照NTC只加引物不加...


引物刚买回来时跑了一次NTC,没有出现扩增,应该可以排除引物二聚体
现在跑标准曲线时NTC有扩增而且溶解曲线的峰和目的基因在一个位置
同样条件的内参跑出来就没有问题
开始以为引物有污染,重新换了一个引物做出来还是这样
另外该目的基因的标准曲线跑出来显示扩增效率200%,是不是由于引物自身扩增的原因?
求助

扩增曲线最右边蓝色为NTC,溶解曲线蓝色的小峰为NTC,试剂用的SYBER GREEN


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mickeylin[使用道具]
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下面是同样条件跑的内参,NTC没有扩增。cDNA都是四倍稀释的。


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排除引物的干扰后,扩增体系的其他成分有无污染,建议用排除法试试。
另,你提到该目的基因的标准曲线跑出来显示扩增效率200%,有些仪器显示的扩增效率是不准的,关于这个问题你可以问问软件工程师。你是4倍稀释,从你提供的曲线图大致可以判断,相邻两浓度的ct值差异大约在2左右,因此判断你的扩增效率大概是100%。
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原帖由 finger 于 2015-11-10 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

排除引物的干扰后,扩增体系的其他成分有无污染,建议用排除法试试。
另,你提到该目的基因的标准曲线跑出来显示扩增效率200%,有些仪器显示的扩增效率是不准的,关于这个问题你可以问问软件工程师。你是4倍稀释,从你提供的曲 ...

因为除了引物,别的试剂和模版还有双蒸水都和内参用的一样,现在内参没有出现问题,是不是就可以排除这些因素的影响呢?引物和水我重新都换过了还是一样,还有什么可能的原因吗?
标准曲线显示内参的扩增效率是100%,目的基因效率200%,我在想是不是NTC也扩增了的原因所以效率比实际的高,请问降低扩增效率有什么办法啊?
谢谢了!
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idea2011[使用道具]
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可以考虑下降低引物浓度,降低退火时间或者温度。另外NTC起峰很有可能是模板污染,另外如果模板长度比较短的话不排除有引物自连的情况发生。建议逐一进行排除。
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换一种酶试试。你扩增的目的片段是什么菌的吗?因为现在的taq酶用的都是工程菌表达的,比如大肠杆菌,所以在taq酶中,或多或少也都会有大肠杆菌的基因组DNA。如果你的扩增目的基因正好是大肠杆菌中的片段,那你无论怎么P都能P出来的。
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mickeylin[使用道具]
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原帖由 idea2011 于 2015-11-10 17:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以考虑下降低引物浓度,降低退火时间或者温度。另外NTC起峰很有可能是模板污染,另外如果模板长度比较短的话不排除有引物自连的情况发生。建议逐一进行排除。 ...

你好,我的引物浓度是SYBER GREEN体系里面最低的了,浓度10uM,终浓度0.2uM,不能再降了
退火温度是跑梯度确定的,这个温度条带最清晰的
NTC本来就没有加模版,应该不是模版污染的问题
我也怀疑是引物自身配对的问题,可是引物二聚体的长度和我的目的基因长度一样的情况可能发生吗?这种巧合的概率也太小了吧
所以现在还是倾向污染的问题
所有能换的都换了现在还是没解决,如果是气溶胶污染有什么好的解决措施吗?
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mickeylin[使用道具]
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原帖由 Darcy 于 2015-11-10 17:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

换一种酶试试。你扩增的目的片段是什么菌的吗?因为现在的taq酶用的都是工程菌表达的,比如大肠杆菌,所以在taq酶中,或多或少也都会有大肠杆菌的基因组DNA。如果你的扩增目的基因正好是大肠杆菌中的片段,那你无论怎么P都能P ...

目的片段是人白介素,这个taq酶会有影响吗?
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Darcy[使用道具]
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原帖由 mickeylin 于 2015-11-10 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

目的片段是人白介素,这个taq酶会有影响吗?

把你的引物贴一下,看看是否有误扩增。你的模板是cDNA多少倍稀释?或者是你的引物设计不好,本身有二聚体,导致NTC也产生扩增
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idea2011[使用道具]
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我最近做PCR也遇到这样的问题,没有给模板的NTC也是有扩增曲线,而且曲线与样本的差不多,CT值在35左右。但是我10月做还是好的,11月就出了问题,突然出的问题。到现在还没解决。
我更换过引物(重新合成),更换过试剂(新开的试剂盒,也更换过不同批号的),更换过配置体系的场所(换了3个场所),都会出现曲线。最后我怀疑是我的ABI7300出了问题,换了7900,刚换的第一次,没有这个现象了。我以为好了,但是第二次就又出现这个现象了。。7900是全部用的96孔板封板完成的PCR。如果说7300气溶胶污染,那还有可能,毕竟有时候是用8联排管做的。但是7900是没有用8联排的。
最近一次换了新批号的试剂盒在7900完成的,又好了一次,但是这个批号的试剂盒做第二次又不行了。真是要崩溃了。还是怀疑污染。
我们PCR室是几个组共用,其他组也出现过这个问题,重新合成了反向引物,是增加还是减少了一个碱基吧,据说是好了。抽空我去问问人家是怎么回事。
忘记说我的是探针法
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