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标题:【求助】溶解曲线双峰

9900[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】溶解曲线双峰


我做的RT-PCR溶解曲线双峰老是有双峰，做了很多次了，在63-65℃出现，是引物二聚体吗，引物二聚体是不是一般在70-80℃出现呢，我用的是ＴＡＫａｒａ的sybregreen试剂盒,逆转录也用的是Takara的，感觉它在37℃15min 后85℃5seconds 就完成逆转录成CDNA，是不是太快了？而且加的RNA 才500ng,加的是不是太少了，一般的加1-2Ug啊，请高手指点啊！


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2015-11-11 15:35
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发表于 2015-11-11 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景太高,产物太少
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发表于 2015-11-11 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

42℃15min ,加2Ug
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发表于 2015-11-11 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ALALA 于 2015-11-11 15:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

背景太高,产物太少

该怎么调整呢？请高手赐教！
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发表于 2015-11-11 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
模板浓度低会导致产物少，重复性差，
双峰八成是引物引起，二聚体的退火温度这可不一定是固定的，毕竟各种引物二级结构都会出现，包括发卡结构多了都会引物溶解曲线出峰
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发表于 2015-11-11 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TaKaRa系统应该是没有问题，用得很多。你的问题可能在引物设计上有些问题，PCR条件或可调整以减少引物二聚体。
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发表于 2015-11-11 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在用SYBR Green染料做定量PCR时，如果Random 6 mers加的太多（标准是终浓度50pmol)，会增加背景荧光信号。从你的溶解曲线看不像这种情况,反转录应该没有问题。
感觉是PCR的引物特异性不好。你跑个电泳看看，可以加大电泳时的上样量，会看得更清楚，看看有没有非特异扩增。
如果你改反应条件还不能解决，建议你更换引物试试。TAKATA免费设计引物，听说效果挺好，你可以找他们试试看能不能解决。
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jude[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主我也用的你这个试剂，请教怎么发图？
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9900[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jude 于 2015-11-11 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主我也用的你这个试剂，请教怎么发图？

附件可加图片啊。在realtime-pcr 仪上可把跑出来的图片单个另外保存，然后加到附件即可！
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2015-11-11 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
溶解曲线是每个循环都测量还是最后一个循环测量？刚开始做 不太清楚
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