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标题:【求助】基因组DNA提取

iii_ii[使用道具]
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试剂盒的费用太高,我想试用一下KI法
提取步骤如下:
1、取EDTA2Na2 抗凝血200μl , 加入到1.5 ml Ep管中,加1.0 ml无菌重蒸水, 10 000 r /min离心3 min,弃上清;
2、加5 mol/L KI溶液40μl,旋涡振荡混合30 s。再加0.9%NaCl溶液100 μl, 氯仿/异戊醇( 24 ∶1,v/ v)混合液150μl,振荡混合30 s。10 000 r /min离心5 min,吸取200μl上清液,转移到另一个Ep管中;
3、加异丙醇120μl,轻轻混匀, 10 000 r/min离心5 min,弃上清。
4、加无水乙醇1.0 ml, 10 000 r/min离心5 min。弃去无水乙醇。加50μl无菌重蒸水使其溶解, - 20℃保存备用。
在加入异丙醇和乙醇后均未见沉淀,电泳也未见条带,求助大家可能是在哪一步出了问题。
另外,我还有一部分血标本,4度放置一周后-20度保存半年,用KI法提取可以吗?
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66+77[使用道具]
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孵育一段时间促进溶解 65 度
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我觉得是这样的,由于陈旧血样的白细胞破碎比较严重点,所以必须使用全血来提取,但是大部分的试剂盒在提取血基因组时.实际上有一般去除红细胞,离心获得白细胞过程,而白细胞本来就讲解不少,导致最后提取的量很少,一般建议直接采用血液来提取,而全血基因组包括两部分,一部分是白细胞破碎释放的基因组(虽然有点讲解),另一部分是为破碎的白细胞的基因组,所以得率更高
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qhyu[使用道具]
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1. 保存时间:4度1周,-20度两个月的保存时间算是短的了,而且不会对质量有致命的影响。而且就有些方法而言,冻存一段时间的血液提取起来更方便一些。-30度下保存了3年的血我们提取的效果也还不错。
2.试剂盒的选择:我看了Takara的试剂盒的操作说明,结合我们现在经常用的一些试剂盒,感觉就是怎么这么憋屈!呵呵!一次性处理的血量少不说,还得那么小心翼翼的,郁闷啊,打死偶也不会用这种盒子。推荐Promega的A1120或A1125,原理和Takara的类似,操作无需小心谨慎,我可以免费提供改良版的操作说明,一次可以处理冻存血600-750ul、新鲜血500ul,成功率近乎100%,60ul溶解后的浓度在100-300ng/ul,1.7-1.9之间。或者可以选择过柱子的试剂盒,MN、Qiagen什么的都可以,看你有多少钱了,只是产量低一些。
3.实验过程中有断档,对人血DNA提取来说一般不会有太大的影响,我们经常在加完溶液2后去休息一会,呵呵。当然试剂盒本身决定的。
4.DNA沉淀溶解的溶剂最好用1*TE,pH8.0,利于溶解,而且利于长期保存。双蒸水就不推荐了,问题多多。
5.沉淀能看到的话,那就不算太少了,60ul溶解完全的话,估计在30-50ng/ul。这样的最好用40ul去溶解。我们自己提取时,沉淀大小通常在0.5-1平方毫米左右的面积。
6.对于提血试剂盒,不要拘泥于它的操作说明中的量,有时候里面给的太保守了。
......

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这位战友,你好,我也是用Promega的A1125提取DNA,但我用的是冻存了近半年的全血,所以DNA含量较低,只有35ug/ml左右,我请问你:用此试剂盒时,最后一步加DNA再水化液可否只加60ul以提高DNA浓度,此外,能否把你“改良版的操作说明”发给我一份呢?我在站里给你发短信了,谢谢!
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战友们,我想问一下你们血液标本的保存方法是从哪得来的。我查了好多文献都没有具体说明。
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555444[使用道具]
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发一些方法供大家参考,附件可以下载,保存-20到-80都可以,3年以内都能提取,非抗凝血也能提取!但是如果要提取RNA就严格多了,采血时立马加入3倍体积的TRIPURE LS,才能保证RNA的质量,参考方法介绍cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2009-5/2009515134112578.htm')
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duchy[使用道具]
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1. 保存时间:4度1周,-20度两个月的保存时间算是短的了,而且不会对质量有致命的影响。而且就有些方法而言,冻存一段时间的血液提取起来更方便一些。-30度下保存了3年的血我们提取的效果也还不错。
2.试剂盒的选择:我看了Takara的试剂盒的操作说明,结合我们现在经常用的一些试剂盒,感觉就是怎么这么憋屈!呵呵!一次性处理的血量少不说,还得那么小心翼翼的,郁闷啊,打死偶也不会用这种盒子。推荐Promega的A1120或A1125,原理和Takara的类似,操作无需小心谨慎,我可以免费提供改良版的操作说明,一次可以处理冻存血600-750ul、新鲜血500ul,成功率近乎100%,60ul溶解后的浓度在100-300ng/ul,1.7-1.9之间。或者可以选择过柱子的试剂盒,MN、Qiagen什么的都可以,看你有多少钱了,只是产量低一些。
3.实验过程中有断档,对人血DNA提取来说一般不会有太大的影响,我们经常在加完溶液2后去休息一会,呵呵。当然试剂盒本身决定的。
4.DNA沉淀溶解的溶剂最好用1*TE,pH8.0,利于溶解,而且利于长期保存。双蒸水就不推荐了,问题多多。
5.沉淀能看到的话,那就不算太少了,60ul溶解完全的话,估计在30-50ng/ul。这样的最好用40ul去溶解。我们自己提取时,沉淀大小通常在0.5-1平方毫米左右的面积。
6.对于提血试剂盒,不要拘泥于它的操作说明中的量,有时候里面给的太保守了。
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总算见到你这个参与提取血液DNA十几万份的大神了!
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summerxx[使用道具]
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用试剂盒提血液里的DNA有的时候不能太过于细心,其实提取血液中的DNA直接用酚氯仿抽屉就可以了
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