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标题:【求助】求助实时荧光定量PCR

dog002[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求助实时荧光定量PCR


我想做实时荧光定量PCR，是荧光染料法，仪器是Roche公司的，做绝对定量,想自己制备目标基因标准品,如何办. 请指教.
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loli[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

扩增目标基因，纯化后，用分光光度计，定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆，转导入大肠杆菌后扩增，抽质粒，可达1X10十二次方，再以每10倍稀释后作为标准品，一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点，起跳的Ct值最好在20-30之间。另外，标准品及样品要同时重复做2-3管，标准曲线的R值在0.98以上，每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上给的建议简洁明了。
我也给点建议，因为荧光染料法的特异性不如taqman探针法的，所以RNA的质量必须保证，先测OD值，再跑RNA电泳，基本上可知道RNA的质量。因为RNA容易降解，只有保证其质量，才能反应真实的情况。这种方法比较适合细胞株，多个基因的检测。如果做的基因不多，都是人类正常基因的化，我推荐应用AB公司的Assays-on-Demand™ Gene Expression Products 试剂盒，价格反而便宜，质量也有保证。
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PINK[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位老大，我想做DNA（非RNA）的定量，带内对照的半定量即可，能否用此法？另，我的量比较大，200左右，导师只给预算1万，能否OK？盼告
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c86v[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我选用MGB探针的话是不是用普通的Taq酶就可以？还有一个问题，HOTSTAR酶可以用于荧光定量PCR吗？
谢谢帮助！！！Wink
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发表于 2015-11-11 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做荧光定量PCR是用的普通Taq酶。
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果冻也酸[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于Taqman探针，Taq酶只要有5'外切活性就可以，HotStart好一些，酶贵一点，我原来做都是用我自己做的Taq酶，效果不错，Mg浓度高一点3.5
如果200个反应定量PCR 8000以内肯定搞定。
大规模做PCR最好用UNG－dUTP 抗污染系统，否则一旦污染就太麻烦了。
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发表于 2015-11-11 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

200个标本，1万的预算你可以直接购买ABI公司的Taqman专用试剂，使用其96孔反应板，既可以保证速度和质量，还可以在预算之内。我曾经做过240个标本，包括预实验在内，只用四天就搞定了（事先提好了DNA）。自己合成引物和探针，没有问题的。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我问过ABI公司的，他们的探针和引物倒是不是很贵，就是那个金牌TAq酶贵。好像一万元搞不定的。假如你买一个目的基因的试剂盒和一个看家基因的试剂盒的话
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ffaa[使用道具]
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发表于 2015-11-11 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不需要什么特别taq的，上面smmu不是说了么。我们用的是1毛钱的酶，结果很好的，我曾经贴过图的，从LCM切下来的东西里括出来的，3个复孔拟合的很好的，我认为用taqman的方法自己设计引物和合成探针最好了。
当然如果你有热启动，那最好了，我们是一大批没有用完。另外用普通PCR检测特异性还可以就算了。
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