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标题:【求助】原核表达电泳分析请教

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发表于 2015-11-15 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达电泳分析请教

如图，我做原核表达之后重组质粒诱导和空载诱导了同一位置都有条带，但是重组的要高得多，条带位置也正确的，这怎么解释啊！（注：2、3泳道是诱导前的空载和重组，4、5是2小时的空载和重组，后面依次是4小时、6小时、8小时的，Marker新买的，天根的，应该是有问题，从上到下依次是94KD、60KD、45KD，我的目的条带是47KD。）


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2015-11-15 11:30
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发表于 2015-11-15 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

虽然marker不太好，但是能看出来你的目的蛋白位置正确，至于空载体，应该是本底表达与重组蛋白位置相近。你的PAGE多大浓度的？47kD的蛋白跑这个位置说明分离胶浓度偏低，建议提高浓度，这样分离的效果会更好。
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发表于 2015-11-15 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

电泳效果不是很好，下次可以注意调整胶浓度，注意上样量一致，控制电压。

看上去还是有表达的，而且表达量还可以，但不能确定，毕竟目的位置处条带还是有点杂的
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灵魂[使用道具]
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发表于 2015-11-15 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

最近做了N块胶，有15%的分离胶，也有5%-20%的梯度胶跑出来的蛋白不成条带？？以前不这样啊？
菌液IPTG诱导完，离心沉淀菌体，PBS重悬，加4XSDS上样缓冲液（终浓度为1X）煮沸5min，13000rpm离心12min，在4℃保存，第二天电泳。
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发表于 2015-11-15 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

会不会有降解啊？有没有蛋白酶抑制剂啊？
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yayayu[使用道具]
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发表于 2015-11-15 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

可能配胶缓冲液或者电泳缓冲液有问题
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灵魂[使用道具]
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发表于 2015-11-15 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)
1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.原因二：样品溶解不完全。
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发表于 2015-11-15 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

建议你把上样缓冲液和电泳缓冲液重新配一下试试
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发表于 2015-11-15 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

可能跟你的电泳条件和目的片段大小有关系，我做SDS-PAGE的条件是60V跑半个小时，过浓缩胶，然后120V跑1h，目的片段有60Kda的、40KDa以及20KDa。样品变性完直接上样进行电泳。胶浓度为12%，你换一下胶浓度和电泳条件，可以通过你的Marker来判断。希望能帮到你，祝你试验成功。
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