电分析

这是为什么呢，因为我的研究生课题其中一部分是大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)二维电泳，我做了整整一年二维电泳都没有结果（另有一年在做基因芯片），我真是想死的心都有了，如果我还做不出来，老板是不会让我毕业的，我不想再延期了，呜呜呜，身边求助的人都没有，我只能整天埋着头做实验，蛋白质组相关的文献和书籍不知道学习了多少遍，还是没有用，实验失败了无数次，我怎么办啊，怎么办啊。。。。。。只希望路过此帖的朋友能帮我下，我真的是一点办法都没有了，我的问题如：

银染图很漂亮,考染图差距太大,这只是染色方法不一样吗?
考染图,酸性端横纹很多,IEF聚焦不好,或者根本没有聚焦,仔细想下自己的操作有什么该注意而没有注意到的细节.
比如,IPG胶条是否完全浸润到样品上. 样品在上样前有没有离心一下,去除不可溶性杂质. 还有就是样品中的盐离子浓度高也影响聚焦. 例外检查下酸性端的胶条是不是有问题啊.我也碰到过类似问题,换了一批胶条就没问题了.
总之,影响结果的因素较多,楼主要逐一排除,找出问题根源.

你的银染图很漂亮,怎么会质谱鉴定不出来呢,奇怪啊.
样品处理是否得当啊.
还有银染灵敏度高,取单个点去做质谱,也可能量太少,质谱鉴定不出.
没有细节不好妄加推断.

考染上样量是银染的好几倍吧 聚焦时间也要相应增加一些
你可以把具体条件详细说明一下 大家也好帮你分析

银染的IEF是100v，1h；200v，1h；500v，1h；1000v，1h；1000-8000,1h；65000vhr；500v，8h
考染的IEF是100v，3h；200v，1h；500v，1h；1000v，1h；1000-8000,1h；85000vhr；500v，8h
还有就是银染上样量是50ug，考染上样量是500ug，其他的都是一样操作，IEF都很正常，顺利聚焦，我就不知道是不是银染上样量少，考染上样量多杂质就相应的多起来了，才会导致酸性端聚焦不好呢

谢谢群友的提醒，因为二维电泳细节太多了，我没法一条一条的列出来，银染不知道为什么就是鉴定不出来，尝试了很多种与质谱兼容的银染法，都打不出来，考染就很好打了，一下就打出点来了，这是我的银染胶内酶解步骤：

1. 用双蒸水洗银染后的胶2-3次，每次10分钟。

2. 剪刀将 200 μl Eppendorf 吸头尖端剪掉约1cm，孔的直径约为1mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μl离心管中。

3. 每管加入50μl脱色液（100 mM 硫代硫酸钠与30 mM 铁氰化钾1:1混合），加完震荡，颜色脱去后马上加水冲洗停止反应，震荡，2分钟内吸出。再加水数次，直至洗掉全部脱色液为止。

4. 加入50%的乙腈，洗1-2次，每次15分钟。

5. 100%乙腈脱水1-2次

6. 25mM 碳酸氢铵吸涨5分钟。

7. 100%的乙腈脱水后，冷冻真空干燥20分钟。

8. 加入8μl (浓度为10ng /μL)溶于20mM碳酸氢铵的胰蛋白酶（测序级）4℃吸胀1小时。吸去多余的酶液，将管子倒置，37℃空气浴过夜。

9. 每块胶加入8μl 5%三氟乙酸，37℃ 1小时，将液体吸净转移至一干净的离心管中，每个蛋白质胶块再加入8μl 2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30℃ 1小时，吸出液体与前一次的提取液合并，抽真空

10. 抽干的样品可于4℃放置一个月，也可用2μl 0.5%三氟乙酸充分溶解肽段立即进行质谱鉴定

银染图很漂亮,考染图差距太大,这只是染色方法不一样吗?
考染图,酸性端横纹很多,IEF聚焦不好,或者根本没有聚焦,仔细想下自己的操作有什么该注意而没有注意到的细节.
比如,IPG胶条是否完全浸润到样品上. 样品在上样前有没有离心一下,去除不可溶性杂质. 还有就是样品中的盐离子浓度高也影响聚焦. 例外检查下酸性端的胶条是不是有问题啊.我也碰到过类似问题,换了一批胶条就没问题了.
总之,影响结果的因素较多,楼主要逐一排除,找出问题根源.
PS: 实验操作细节一点要多加留心额~

我也怀疑过是不是考染IEF根本么有进行啊，是不是我在做梦，每次看到悲催的考染图我都想死，为什么银染和考染都是一样的操作，一个批次的胶条，银染就好好的，考染就不行呢，上样前都离心过的，如果是盐离子的影响的话，为什么只有酸性端是这样啊，不知道是不是核酸或者是脂类物质影响，我用过tca丙酮法，蛋白很难重溶，超声也溶不了多少，而且跑出来的也是酸性端都是横条纹，还不如沉淀之前的

个人觉得，丙酮沉淀的效果，真不如再离心一下的效果。

上样量在正常范围内，不过你蛋白浓度多少呢？如果说因为考染的上样量增加了而导致杂质也增加了的话，我觉得问题还是出在样本纯化上。其实我一直做银染，对考染不了解。不过你这个是不是胶体考染啊，貌似胶体考染效果会好点。

关于银染的打点，只要确定不用戊二醛，除了量多少的影响，应该就没问题了。或者你干脆挖下来点，送出去鉴定好了。这样结果出的也比较快。

我想问一下我这种情况，到底是不是核酸的影响呢，我在想到底要不要买DnaseI和RnaseA呢，如果是脂类或者糖的影响，那就只有用沉淀试剂盒处理了吧