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标题:【求助】人血单核细胞提取中的几个问题

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发表于 2015-12-1 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】人血单核细胞提取中的几个问题


刚开始做实验，想从人静脉抗凝血中分离单核细胞作RNA提取，有以下几点不明白，请教高手！
1）从全血中分离单核细胞一般怎么做？我看有人单核细胞分离液卖，有战友用过吗？效果如何？我看大家用的是淋巴细胞分离液！
2）5ml全血可以分离出多少单核细胞？提RNA够了吗？可以提大概多少量的RNA？
3）新鲜血采集了最好马上就分离单核细胞，之后是否可以先保存起来？保存条件是什么？
4）我看天津一家公司的淋巴细胞分离液说明书，要抗凝血和Hank's液混匀，请问Hank's液是什么？哪里有卖？
谢谢！
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发表于 2015-12-1 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回答：
1）从全血中分离单个核细胞（mononuclear cells,MNC）或有核细胞（nucleated cells,NC）可以用Ficoll(也即淋巴细胞分离液，比重1.076-1.077)或者Percoll液进行分离。常用为Ficoll液。是一种密度梯度离心的原理。分离后红细胞沉降至管底，中间是分离液，上层为血清。在血清和分离液之间的薄层部分即是所需要的MNC。将其吸出至另一离心管中，PBC或Hank's洗一遍。
2）5ml全血理论上含4～10×106（4000000-10000000）个有核细胞，由于Ficoll分离有核细胞的回收率为30%左右，所以算下来可以获得1.2～3×106（1200000-3000000）。提RNA应该是够了。
3）抗凝全血可以放在4-8摄氏度的冰箱冷藏室24h，再分离。
4）Hank's液是平衡盐溶液的一种，具有等渗和PH缓冲的能力。具体配置配方见细胞培养相关书籍中，一般都有。
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发表于 2015-12-1 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上！但是我不是分离单个核细胞，而是单核细胞，买的不是淋巴细胞分离液，而是单核细胞分离液！咨询了试剂公司，此分离液比重为1.075，公司说操作步骤和淋巴细胞分离液相同，但是分离出的是单核细胞，不是单个核细胞，按他说得回收率为80％，那么5ml全血可分得0.8－2×106单核细胞，提RNA是否够了？还有提单核细胞中RNA那么抗凝是用肝素可不可以？
谢谢了！！
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发表于 2015-12-1 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是要做人外周血单核细胞分离，买的是人淋巴细胞提取液。后来看产品介绍还有专门的单核细胞提取液，正犹豫是否要换成单核细胞提取液。不知楼主做过没有，效果如何？请多多赐教，谢谢！
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发表于 2015-12-1 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两种分离液我都用过,其实分离效果都差不多,分离液分离后,如果想得到单核细胞,最好进行贴壁培养,因为单核细胞可以贴壁,而淋巴细胞不贴壁,一般我是加到六孔板上两小时后吸去培养基,所得细胞中单核细胞可以达到85%-90%.我开始用的也是天津的单核细胞分离液,用完后由于代理公司暂无单核细胞分离液,于是就用淋巴细胞分离液,反正都要贴壁培养,效果都差不多,而且后者便宜不少呢.单核细胞的比例可能是占白细胞的3%-8%,如果血易得,建议多取,我一般10-15ml提取rna,用trizol提,效果挺好.
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发表于 2015-12-1 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外,我是用pbs代替hank's液的.
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发表于 2015-12-1 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

吸出来不洗，直接提RNA行吗？
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发表于 2015-12-1 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
，贴壁时间有要求吗，有人说要过夜，时间长点黏附的效果会好些是这样吗？贴壁的细胞你是怎么洗脱的？贴壁培养的细胞对细胞内的信息会有影响吗？PBS和hank‘s有什么区别？还有用RPMI 1640的，这些有讲究吗？
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发表于 2015-12-1 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

贴壁1-2h就行,当然过夜也可以,这看你实验时间的安排了,贴壁后我是用刮细胞的刮子刮下来的,想来如果用trizol直接加到板上也可以,不过我没这样做过.至于会不会对细胞内信息有影响我不太清楚,但如过时间不长,想必影响不大.pbs和hank's如果在这里的作用只是提供等渗和进行PH缓冲,我认为应该都可以,但不知道它们的密度差别大不大,毕竟细胞分离液是依据比重来分的,但是从我的实验来看至少pbs也行.我是用1640培养的,不加血清,因为目的只是让其贴壁,培养时间不长,而且我还要做蛋白方面的时验,所以没有加血清.不要在玻璃器皿上培养就单核细胞不易往玻璃上贴.
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seagate[使用道具]
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 小中大

吸出来不用hanks液或pbs洗，直接提RNA行吗？
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