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标题:【讨论帖】PCR问题

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
simon_ws
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2003-09-13 18:46
---------------------------------------------------------------------------------------------------
请教Mg2+对Ex taq酶的活性有什么样的影响，一般什么情况下加入？
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问taq酶的活性在常温下能保持活性多久？在线等！thanks
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hyuu[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的PCR产物电泳时条带很弱，今天我将模板加量、引物及酶加倍，感觉好一些，但仍不理想，我的退火温度已经降到50度了，但是没有非特异带，酶的质量应该没问题，因为别的产物已经扩出来了。不知还有什么办法。
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发表于 2015-12-1 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问如何选择TAQMAN探针？

======================================================

答：可以到ABI公司的网页看一看，有参考文献。
cuturl('http://www.appliedbiosystems.com.cn/chinese/pe_h2-add1.html')
另外，ABI公司有相关的引物及TaqMan探针设计软件。很好用的。
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发表于 2015-12-1 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Mg++对taq酶的活性是必须的，合适的Mg++使taq酶的活性发挥到最佳。故在PCR反应时应调节Mg++（因dNTP 引物等可以结合Mg++）。
至于taq酶的活性在常温下能保持活性多久，没有定论。不同厂家不同批次的酶差异较大。一般应尽量使其处于低温。一般液态的taq酶，不易保存，在常温下，放几个小时应该问题不大。固相化的热启动taq酶（如华美公司4度PCR试剂盒内的酶管），常温下放置一个月应该问题不大。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
你的问题：不好回答。不过建议采用以下策略试一试：
1。在降退火温度，可以低到45度
2。增加Mg++的浓度
3。将延伸时间加长
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发表于 2015-12-1 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Ex Taq酶 是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')
专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.
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发表于 2015-12-1 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!!
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发表于 2015-12-1 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
有谁能帮我解决相对定量时内参和目标产物的扩增效率问题？
我用的反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 1 ＊(终浓度）
　　　　　　　　　　２mmol/l　dNTP 0.2mmol/l每种
TaQnase 5U/IU 1U/50ul
25mmol/l Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
Template 0.05ng--0.005ng
循环条件:94 5min 1cycle -------- 95 30sec 60 30sec 45cycle
在内参和目标基因初浓度一样的情况下,如何避免竞争抑制使两个基因的扩增效率一致且相对比值接近1呢?
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发表于 2015-12-1 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Ex Taq酶 是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')
专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.

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网站所提供的内容我看了。加入Mgcl2是肯定的。如10XBUFFER含有镁离子就不需要再加了。
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