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标题:【讨论帖】PCR问题

eor[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!!

===========================================

1，可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1
2，合成目标产物作标准曲线是可行的。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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先天性卵巢发育不全综合征
园丁## wrote:
可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1
我的目标产物和内对照基因在相同浓度的情况下，要如何调整两对引物和探针的比例呢，我的反应体系如下：
反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 　　　　　　　　1＊(终浓度）
　　２mmol/l　dNTP 　　　　　　0.2mmol/l每种
　　TaQnase　 5U/IU 　　　　　　1U/50ul
　　25mmol/l　　　　　　　　　 Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l　　1R 1umol/l
intel　refenrence　MGB probe 　　　0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l　　　　　1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
Template １ng--0.005ng
循环条件:94 5min 1cycle -------- 95 30sec 60 30sec 45cycle
你能给我一个比较具体的调节探针和引物的比例的protocol
使目标基因和内对照基因的在初始浓度相等的情况下比例为１吗？
谢谢你给我的帮助！！
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发表于 2015-12-1 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

太好了！我有问题！
我想检测细胞里面TGF teba 1,2,3的表达情况！
已经在genbank里面查到三者的mRNA序列，想设计引物做RT-pcr半定量检测。
设计一个基因的引物除了要考虑这个基因的序列本身，难道还要考虑超家族的其他成员吗，需要避开保守区吗？？？
我在网上查了一下，发现有的文献上提供的引物序列，有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，能扩出来目的序列吗？
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发表于 2015-12-1 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验是靠自己做的，别人只能给你提一些建议，我这里没有protocol。至于引物与探针之间的比例，可以1：1，1：2，1：3的多设计几组进行调节
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发表于 2015-12-1 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
太好了！我有问题！
我想检测细胞里面TGF teba 1,2,3的表达情况！
已经在genbank里面查到三者的mRNA序列，想设计引物做RT-pcr半定量检测。
设计一个基因的引物除了要考虑这个基因的序列本身，难道还要考虑超家族的其他成员吗，需要避开保守区吗？？？
我在网上查了一下，发现有的文献上提供的引物序列，有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，能扩出来目的序列吗？
......

===============================================================================================================

你的引物设计在哪个部位，自己可以查资料。但设计引物时，不要太相信软件了。经常是有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，却能扩出来目的序列来。
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发表于 2015-12-1 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该是调整引物（目的基因：内标）和探针（目的基因：内标）的比例。
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2015-12-1 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，这是我的问题
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发表于 2015-12-1 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知道怎么回事，PCR的结果总是很奇怪：
可以P出目的片断，但是很弱，然而上样BUFFER前面的那条带倒是很亮（我估计是引物二聚体），每次都有这样的结果，高手能告诉我原因在哪里吗？
我用的引物是五月份合成的，我配好后，只做过一次PCR，当时目的条带很亮，然后冻存在－20度，直到这个月初才拿出来继续做，是不是引物有问题呢？因为我的模板是才抽的质粒，酶切是有目的基因的。
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发表于 2015-12-1 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人细胞数量有限，达到10的7次方数量的细胞很困难，请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
此外细胞数量少的话有什么方法可以提高trizol的提取效率？是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？
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发表于 2015-12-1 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用外文文献中找到的引物和genebank对，若实在找不到，在genebank中找到所要扩增的序列，自己设计引物。
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