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标题:【求助】体系中甘油和DMSO的作用

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】体系中甘油和DMSO的作用


我做SYBR的时候出现了引物二聚体，跳过退火温度和引物浓度后效果都不好，在园子里查说可以在体系中家10%的甘油或5%的DMSO，可加了甘油或DMSO后，PCR根本跑出来了。
不知道各位有没有遇到这样的问题，加了甘油或DMSO后会对反应体系产生什么样的影响。
非常感谢各位帮我解释。
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rfv[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

dmso应该是促进pcr反应，甘油我就不知道了，我一直以为甘油只是为了使酶不发生冰冻。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可我的怎末在没加之前还跑出来了，只是有二聚体而已，而加了之后就什么都没有了呢，郁闷啊。
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你具体反应体系如何？提高mg离子试试，应该是反应体系的问题。
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duchy[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DMSO的作用是增加DNA分子的刚性，减少引物二聚体的形成以及模板之间的复杂二级结构的形成。当体系中加入DMSO时，可适当降低退火温度。
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feixi[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做PCR反应时，有很多的PCR添加剂。不同的添加剂，对PCR的影响不同。
甘油和DMSO的作用是一样的：降低双链的结合力量，减少非特异的产生。
但是，添加剂的使用是有讲究的。主要体现在“量”的控制。
不同的PCR反应体系，添加剂发挥“正面作用”的的浓度是不一样。所以，如果需要使用PCR添加剂，都需要一个浓度梯度的优化。
加入量太少，添加剂不发挥有效的作用。
加入量太多，添加剂会影响甚至抑制PCR的扩增。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚才又做了一锅，把甘油和DMSO的浓度降为5%和2%，把退火温度也降了一度，不知道结果如何。
再次感谢大家的热心指点。
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SO2[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对这些添加剂不能太迷信了，我做PCR体系的优化的时候试过很多PCR添加剂，都做过梯度实验，结果都是一样的，浓度低时，没有影响，到了一定的浓度抑制反应。倒是钾离子、镁离子、铵离子之间的比例对PCR有很大的影响，镁离子的影响最大，我通常都用均匀实验做一次三因子的优化，有很好的效果，一次实验就可以找到最佳的浓度配比。
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sunbent[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
与其折腾着添加剂，不如更换引物！
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-12-1 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。
DMSO: 主要用于高GC含量的模板扩增，可能的机理是改善CG含量高的DNA的变形情况，降低其二级结构，使得聚合酶在二级结构处延伸，一般超过体积的10%会影响其保真性。
甘油：保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量，
甲酰胺：促进引物－模版退火，降低带有二极结构的DNA的变性温度。
硫酸胺：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性以及退火温度。
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