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标题:【求助】定量PCR一定要做内参吗

PCR[使用道具]
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【求助】定量PCR一定要做内参吗

我在做开题时报告了我的荧光定量PCR结果,有的人说没做内参,投稿时会因数据不可靠而被拒稿,有的人说我的RNA是来自不同时期的标本,它们之间是相对关系,不用做内参,把我搞糊了,请问各位高手,到底用不用。
B-actin是荧光定量的内参照,还有其它内参吗那么什么时候一定要做内参,什么时候可以不做,如果不是人的RNA怎么做内参呢?
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seagate[使用道具]
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2
 

实时荧光定量PCR的定量方式有两种:
1.绝对定量:如检测人血液中HBV病毒的绝对数目等。这需要有标准品首先做一个直线。然后再检测你的样品来绝对定量;
2.相对定量:相对定量需要做内参,除了B-actin,其他的像GAPDH也可以的。
你的情况是做相对定量,还是要做内参的,其实各种生物都表达一些看家基因的像你用的B-actin。
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duchy[使用道具]
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3
 

作为你的发表文章,你测定不同时期的样本的量,应该加入内参照。
加入内参
一、可以监控你不同样本提取过程所造成的差异。
二、可以消除样本量的差异,避免样本量的不同所造成的差异。
三、可以消除样本中抑制物对实验结果的影响。
作为内参照主要是对你的测定结果进行数据校正。使它与你的实际结果更符合。
每种生物 都有house keeping gene,你加以选择就行。
其实人们说的绝对定量和相对定量我认为都是相对的,加入内参就一定绝对定量了,并不是如此。
两对引物和探针之间的相互影响是不可否定的,只要做过双重荧光PCR的朋友肯定有体会。其实国内采用的绝对定量主要是利用标准品和经验值修正过来的,没有绝对定量的产品。
发表文章内参是一定要带的,否则漏洞太大。
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PCR[使用道具]
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谢谢楼上两位的详细解答,还有一点不明,我已经做了质粒的标准品,做的是时实荧光定量PCR,Taqman探针标记,做前测RNA的OD值,使各样品OD值一致,结果推算出原样品的拷贝数,还需要做内参吗?
因为我的标本的基因序列不是很清楚,同物种的基因序列拿来试试倒可以,但成本太高了,所以我一直在找一个比较合理的理由把内参省掉,是不是真的可以省呢,请各位站友多指教!
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wu11998866[使用道具]
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5
 

做定量RT-PCR,严格来说一定要做内参.因为反转录过程的效率不同试剂盒\不同实验室的差别是非常大的,其它影响因素YTHT88已提到
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summerxx[使用道具]
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6
 

做DNA的实荧光定量PCR需要内参吗?用GAPDH的cDNA设计的引物可以吗?
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yhn[使用道具]
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7
 

DNA就无需内参啦,只有CDNA就需要内参作对照。
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shenkunjie[使用道具]
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一般来讲,要做定量就应该有内参。
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vera+[使用道具]
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9
 

当然要有内参啦,以校正抽提,RT,及起始细胞数的组间差异,
当前有文献报道用到几个内参照,以校正各管间的PCR反应效率
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Darcy[使用道具]
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为什么以DNA为模板就无需内参?
RT存在效率的差异,PCR也存在效率的差异啊?
这两个效率的差异需要分开来看吗?
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