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标题:【求助】做荧光定量PCR扩增效率很低是为什么?

阿敏[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做荧光定量PCR扩增效率很低是为什么?


扩增曲线总是上不去,在一个较低的水平就到平台了,而且融解曲线的峰也很低,很少能上0.10以上.连内参GAPDH也是,怎么回事啊?
25 ul 体系用了2ul的摸板和2l的引物,是不是太高了?
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

太高了吧，我一般只加１ul模板和０.５ul的引物
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模版有问题，建议你纯化一下模版。而且模版加的太多了。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是模版提取过程中残留的抑制PCR反应的物质在起作用，建议你把模版稀释几倍试试。引物量要适当，一般在0.1~0.2微摩。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能一:模板浓度太高了.模板总量一般不超过100ng
可能二:引物太多了,终浓度0.2uM就可以了,也就是10pmol/ul的引物只需0.5ul就可以了.
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yysr238[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模板可能含有不纯杂质，会影响扩增效率。另外，你加的模板浓度也高了点，少加点。
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发表于 2015-12-4 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！
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发表于 2015-12-4 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 eor 于 2015-12-4 09:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！ ...

建议用氯仿再抽提，不要加酚。
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物和探针100µM，各0.1µL就OK了Shy
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

模板是否太多不好说，因为不知你作反转录时tRNA用了多少，所以不大同意上面几位战友的意见，我在其他的试剂盒说明书里曾看到每２０体系里可以加入200ng tRNA，我认为扩增效率不高可能是因为你的tRNA提的不好，不知你目的基因的长度是多少，建议你重新提取RNA，再试试吧，这就是科学工作的意义。
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