【求助】甲基化PCR

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标题:【求助】甲基化PCR

西子[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增的方法做甲基化。PCR有大小合适的带但还有一些杂带，测序结果也是很多杂峰，不知道如何提高特异性。是酶的原因吗？大侠们帮帮忙！

join[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加大在引物中的CpG岛数目试试，最好是正反引物都如此。

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是酶的原因，我用的是TakaRa 酶，如果有非特异带，可以试一下后加入酶，也就是先将配好的反应液放入PCR仪，待到95度后再加入酶

西子[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的引物中不包括CPG岛，我用的引物既可以扩甲基化的模板，也可以扩非甲基化的模板，即 BSP法，不是分为甲基化和非甲基化2对引物（MSP法），请问是不是也要用hotstarPCR

yizhi[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得啊，你可以切胶回收啊，然后做克隆。用克隆的产物再跑胶和测序，相信特异性就会很高的了。如果你直接用pcr产物去测序的话，要求是很高的，很难达到。

okhaha[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你是BSP，特异性不高，有以下两点要考虑：
1. bisulfite sodium modified 使C变T，大量的A、T使得引物与模板错配机会大增，所以在设计引物时一定要小心比对错配引发。
2.如果你体系已经确定，最好做降落PCR。热启动的缺点：一方面太烦琐，特别在样本多的时候；其次，效果不明显。

PCR[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们这里有人和你做的一样，也是BSP。没有用hotstart PCR。

西子[使用道具]
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发表于 2015-12-4 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不用hotstar效果好吗 ,我换了hotstar后效果好多了,看测序情况咋样吧.上帝保佑

西子[使用道具]
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