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1.只要取组织是在组织离体30min内完成的、并且立即放入-80或液氮中保存的就对实验结果不会有影响。建议取材时将组织置于灭菌的冻存管中保存在液氮罐,取材前可以设计好每管中存放的组织量,以便后来RNA抽提时取用方便。有条件的话最好先在液氮中速冻,再放到-70℃中保存.快速冷冻能有效地防止RNA的降解.若直接放置于-80度,样品的冷冻过程还是有点慢.
2.冻存管也最好用DEPC处理.国产的很多塑料制品都比较脏,管内会有一些含RNA酶的东西.一般我们采样用来包装样品的锡纸也要经过高温烘烤去除RNA酶的.
3.RNAlater一般用于不方便用液氮冻存的样品,或在不方便带液氮罐的情况下使用.但它对保存的组织大小有一定的要求,要切成比较小的块状,进口的RNAlater也比较贵.目前有QIAGEN公司的RNeasy Protect Kits提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent,只要在采样后立即加入这种试剂,即可保护样品中的RNA完整而不被降解。在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天,或者在18—25度保存7天,2—8度稳定4周,或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样,运输和保存样品提供了极大的方便,特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞,但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。
RNAlater的用法非常简单,只要在采样后立即将样品完全浸入适量(10ul/1mg组织)的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索,组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜,对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中,较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块,以确保RNAlater能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液,避免组织块挤在一起,同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品,对于冷藏和包埋的样品请选用RNeasy Kit。
保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构,可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA,剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点,但对不会影响匀浆过程。
实际上,抽提组织总RNA时,如果发生降解,最可能的环节是组织从液氮或-80冰箱内取出后解冻时间过长或使用匀桨器匀浆时操作时间过长,导致组织内细胞破裂释放RNA酶,而RNA酶灭活物质异硫氰酸胍又不能及时于之接触并使其灭活,因而将RNA降解。因此,现在我们在抽提总RNA时一般是取一定量组织放入碾钵内,边碾磨边加入液氮直至成粉末,然后加入到Sol D中,这样很少有降解的。
当然,在抽提过程中DEPC处理tip及相关设备和带口罩、勤换手套防止RNA酶污染也是极为重要的。