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标题:【求助】PCR产物是否可以直接酶切呢？

铜雀[使用道具]
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发表于 2015-12-4 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物是否可以直接酶切呢？


我想对PCR产物分析一下，全部测序太贵了，不知道PCR产物是否可以直接酶切，需要注意些什么问题。谁有没有比较好PCR产物直接酶切的protocol呢，请给我传一个，本人不胜感激！
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发表于 2015-12-4 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

产物加2倍体积的无水乙醇，0.1体积的乙酸钠，-20度放置1h，12000g，5’，依照你的酶切体系水溶DNA。
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发表于 2015-12-4 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你要如何酶切分析？两端的酶切位点切下来也无法判断。如果要鉴定内部位点，也许也没有错 但还是会有其它位点突变。不知道你想要什么。至于pcr产物的纯化 买个kit方便省时省事。
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发表于 2015-12-4 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR产物当然可以直接酶切，主要看限制性酶的性质和酶切条件，但不知你要酶切来干什么？
我做了几千个样本，全部是PCR后直接酶切。
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发表于 2015-12-4 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正想请教这个问题呢（最近听别人说PCR 产物需要回收才能进行酶切），我酶切的目的就是要看看能不能切开，用于 检测某一位点的突变 ，不知直接将 PCR 产物进行酶切是否会影响检测结果！如果我模板的纯度不是很高而又不影响PCR 扩增结果的话，是不是也能直接进行酶切？
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 小中大

可以的，我曾经就直接把酶加入PCR反应液，酶切顺利。不过关键视乎酶本身。你最好分别看一下PCR反应体系的离子浓度和酶buffer的浓度，看看是否匹配；如果不匹配，你也可以通过添加少量的酶10×buffer或稀释来使其匹配（记注无论如何要把PCR本身的离子浓度考虑进去，不能当作无离子液体处理）为了提高酶切效率，最好相对缩小PCR原液在酶切反应体系所占比例（因为PCR反应体系中可能有抑制内切酶的物质），建议加大酶的用量。
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发表于 2015-12-4 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酶切位点多在PCR产物两端，酶切后除了两个酶切位点中间的一段，剩下的最多只有几十个碱基，电泳根本看不见。你如何判断是否切开了呢？
当然，理论上切开的片段是要比没切开的跑的快，但你看不见啊！
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 小中大
你的PCR用的是多大的体系，如果是10ul 的，根据产物的电泳条带，如果较亮，去3-5ul 全部加入酶且体系即可，如果产物量不太大，九把电泳剩下的7-8 ul 全部加入酶且体系吧！一般都可以的。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2015-12-4 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我曾经做过PCR后直接内切，我扩的是CYP11b2，醛固酮合成酶，产物为537bp，经内切后直接电泳，产物为273或202bp及一些小片段。8微升pcr产物，加内切酶和缓冲液各1微升（说明书），37度水浴过夜即可。
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铜雀[使用道具]
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发表于 2015-12-4 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你要如何酶切分析？两端的酶切位点切下来也无法判断。如果要鉴定内部位点，也许也没有错 但还是会有其它位点突变。不知道你想要什么。至于pcr产物的纯化 买个kit方便省时省事。

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我是想通过产物内部的酶切位点来判断其是否属于同一等位基因。至于位点的突变就管不了那么多了，可能突变的频率也不是很好，可以忽略吧
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