【求助】SYBR GREEN I -Real time pcr疑难

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】SYBR GREEN I -Real time pcr疑难

31 1/4 1 2 3 4 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】SYBR GREEN I -Real time pcr疑难

伊莎贝拉[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79367
精华 0
积分 253
帖子 226
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

发表于 2015-12-4 11:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

偶用sybr green I 作real time pcr, 提细胞株的RNA经PROMEGA 的反转录合成cDNA，然后用SYBR GREEN I 在ABI 7000机子上作-Real time pcr。在上机前偶用普通的PCR确定了反映体系，然后加了染料用的是20X的，25ul体系最终浓度是0.3x,但结果示根本没有扩增！！样品管和阴性对照的曲线差不多，偶以为是体系不好，将反映完的产物跑了电泳，发现样品有特异的目的产物，而且好像量还不少，因此就疑惑了？是什么问题呢？是不是我的染料加得太少？还是染料失效了（是刚买的呀）？敬请各位高手指教！谢谢

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2015-12-4 11:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是QIAGEN的试剂，20ul体系中10ulSYBR，终浓度是1X，比你的高多了。我不知道你用的是哪里的试剂，你看看试剂说明上推荐的浓度是多少。SYBR GREEN的Protocol相对比较固定，我觉得你调到1X应该差不多。

TNT[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75639
精华 0
积分 455
帖子 610
信誉分 100
可用分 3826
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态离线

发表于 2015-12-4 11:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我买的是国产的便宜，它的说明书上写的是0.3-1X,它说"通常0.3x可以得到好的结果“，所以我就加了0.3x，结果一片空白，
Sad我开始怀疑是否是我的体系的问题，以为加了染料会影响效率，但电泳后我知道体系好像是可以用的。我的体系是Mg2+:3mM,dNTP:0.3mM,引物：0.3uM;TaqE:0.05u/ul
还要请教，要是提高染料到1X,是不是要提高Mg2+的浓度？应该提高多少合适呢？thanks!

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2015-12-4 11:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你的体系没有问题。
关于Mg离子浓度，Qiagen的SYBR GREEN I提供了所有反应所需的成分，其中Mg离子浓度为2.5mM，他们强烈推荐2.5mM为起始浓度，个别反应需要调整，可以调到5mM。不过我用SYBR GREEN做了不少基因，一般都用2.5就可以。但是在Taqman系统，我们做的优化，Mg大都在4.0左右。我觉得如果需要调整，你可以调在5以下。
另外是不是其他原因，比如chanel、gain。

伊莎贝拉[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79367
精华 0
积分 253
帖子 226
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

发表于 2015-12-4 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

thanks! 我们的仪器刚坏过，好像是什么东西烧了，弄回来以后，他们用CMV的试剂盒试过一次，据说是好的，我现在也搞不懂，准备下次提高染料浓度，并和他们一起做做，看看到底是怎么回事。不知道主任说的如果是chanel、gain的问题应该怎样检测呢？
另外还哟是关于标准曲线的问题，我看到主任等一些高手在园子里说最好是将目的基因接到质粒中作，或者也可以使用PCR产物。但我这儿没条件作质粒，我们这儿的人是将cDNA做成梯度（应该是估计值），拉标准曲线；而用一步法作RT-PCR的则用RNA做梯度。我使用的是两步法，要求最好定量能精确，我现在不知道用哪个更好呢？

Darcy[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71238
精华 1
积分 420
帖子 495
信誉分 102
可用分 3271
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态离线

发表于 2015-12-4 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态离线

发表于 2015-12-4 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的taq man 荧光定量 Mg离子25mM加1.5ul，结果就出现非特异带，mg离子浓度越高非特异带越亮，但是我在bio－rad pcr仪器上就没有，是不是我们的rotor－gene 定量pcr仪器升降温太慢的原因？？？另外我想知道非特异带影响我的荧光定量的准确度吗？是不是要测序看看非特异带包含probe吗？？

==============================================================================================================

由于SYBR GREEN I是一种可与双链DNA结合的染料，所以应用此法一定要检测扩增产物特异性。一个简单的方法是补做一个熔解曲线就行了，就是从在20min内60度升到95度，看熔解曲线。如果是只有一个峰，说明特异性好，如果引物的位置也有峰，说明你要降低引物浓度，如果其它的峰出现，就得重新设计引物了

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2015-12-4 11:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用的是什么机器，我说的CHANEL、GAIN是机器获得信号的方式，如果选择不对也得不到想要的结果。Rotor-gene3000可以自动检测，rotor gene2000必须手动，调整raw data中荧光信号在5－10之间。其他机器我就不太清楚了。

我个人认为两步法比较好，好控制，出问题容易调整，定量也更精确。关于标准曲线，严格来讲要用质粒做，因为用PCR产物很难控制PCR中有没有非特异性扩增，是定量不准。如果没有条件作质粒，可以纯化PCR产物后作标准曲线。

summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2015-12-4 11:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

作两个阴性对照，一个加与模板等量的水，另一个只有mastermix，如果这两个里面没有信号，可以认为没有非特异性扩增。我觉得这种非特异性条带不影响结果，因为探针是特异的。关于溶解曲线，SYBR GREEN 可以做，taqman作不出来。

xuuuu[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 118128
精华 1
积分 444
帖子 503
信誉分 102
可用分 3386
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-12-10
状态离线

发表于 2015-12-4 11:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

probe应该野有可能结合到我的重组质粒别的位置啊！如果引物扩增的区域包括probe非特异结合的位置，那么不就有荧光了吗？这样荧光量就偏大了啊！！！

31 1/4 1 2 3 4 ››