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标题:【求助】RNA提取后只看到两条带，为什么？

JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】RNA提取后只看到两条带，为什么？


提取的是小鼠肿瘤细胞，数量2.2*105每孔
转染干扰RNA后DMEM无血清培养38小时进行提取。
以前提未转染的细胞时，异丙醇离心后可见明显沉淀，跑胶可见三条清晰的带。这次看不到沉淀，抱着试试看的心理，7ul无RNA酶水溶解，因临时有事，－80度冻了一天半，今天跑胶成了这个样子。
1 ，2，4,标记为转染组，5为只加了转染试剂，而没加siRNA, 6为两者都没加。
望高手解疑：1）此次看不到沉淀原因何在？若是转染造成的，那第6孔为什么也看不到？ 细胞数量与以前未转染提取时数量级一致。是无血清培养所致？
2）跑出来的条带是RNA吗? 若是，为什么是两条，降解了吗？ 第6孔一条带怎么解释？
3）另一个小问题:整张胶中部斜着一块较亮的区域是怎么造成的？最前端那个条带前后的暗区是什么原因造成的？溴酚兰吗？
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bojitu[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下只是参考意见
首先：你的细胞的数量级，按理说，在isopropyl alcol 后，不应该产生沉淀。如果能用肉眼看见沉淀，则很可能是DNA 污染 另外我想知道你转染剂用的是什么， 我不太清楚，你在无学清状态下 培养38小时，细胞状态如何。如果细胞状态不好，RNA 极有可能被酶降解。
其次：你的图，我觉得不是RNA ，或者说降解极为严重，为了确认是不是降解严重，你可以用1kb 的MARKER 最后由positive control 来确认一下条带的距离., 另外在loading　过程中，loading buffer tank buffer 都容易使RNA 降解，也就是说如果用一般的DNA 用 配液不一定能反映出真实的RNA 状态。
另外：你的两的区域是EtBr 所致。建议你在做胶时，直接将EtBr 加进去。
这样胶就会均匀染色了
然后，我想知道你的6号， 与1，2，4
号的区别是什么
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就按你回复的顺序作说明或讨论
1.细胞数量级的问题：可能当时没弄对，显示成2.2乘105了，应是 10的5次方，这个数量级上一次（指含血清培养，未进行转染，下同）是提出来了的； 异丙醇一步不是用来沉淀RNA的吗？前一次这一步后是见到清晰沉淀了的，而且跑胶结果很好；转染试剂用的LIPO2000, 关于细胞状态，有一些死亡，但很少，不影响数量级，形态与正常培养的有差异，主要表现为细胞回缩，少有棱角，细胞也没有在提之前的PBS清洗一步丢失；对“RNA 极有可能被酶降解”一句不懂，希望得知其中详细。谢谢！
2.若是RNA降解，为何条带如此清晰规整？因仅用7ul溶解没见到的“RNA”，这次跑胶用去4ul,剩下的都不够再跑一次了；跑胶用的1ⅹTAE，由50ⅹ的用DEPC处理水配制而成，前一次也是如此操作。
3.EB是配胶时添加；仔细检查胶上并无液体或其它肉眼可见异常；我所指的6号与1,2,4,号的区别是为何6号跑出来只有最前端一第带。
再次感谢sx2117,也期待更多的人参与进来。
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yysr238[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。一般情况下，10 的5次方的数量级是不容易看到沉淀的，只有DNA 才容易被看到沉淀。你确定跑胶效果很好吗？我指的是条带亮度分布，是否有拖带。
2。我觉得RNA降解的可能性极大。好的ＲＮＡ如果没记错，应该是３～４个条带，上面两个（２８ｓ，１８ｓ）下面两个，而且相对来说上面的应该亮一些。可是你的
ＲＮＡ很难判断究竟是不是ＲＮＡ。我在做转染时，一般５小时无血清状态培养，然后overnight 稳定化（含10%FBS的培养基 培养）转染效果很好，不知此法对你的细胞是否起作用（一点小参考）一般我用Trizol提取RNA 时，10的5次方数量级的细胞能提取几微克的RNA，并且 基本上是溶解在20~30微升的DEPC-DW 里。在我看来你的提取量太少。 另外，用Trizol 提取时很容易造成DNA 污染（请问你用的提取剂是什么，不知你前一次的提取中看到的沉淀是否是ＤＮＡ）
3。 看你的图。我肯定是你的提取过程出现问题 而不是因为转染（你的1，2，4 为转染吧）。建议重新审查你得提取步骤（比如，RNA 酶污染， 离心温度 等）
4。如果你是在配胶时加的EtBr ，那肯定没均匀，所以建议搅拌一下，或者摇匀。
5。我不清楚你提取RNA　的目的是什么，　如果只是单纯ＲＴ－ＰＣＲ　那么我建议你直接ｐｃｒ内参基因。这样可以避免ＲＮＡ　的损失　和　实验步骤地出错。
６。ＲＮＡ既有可能被降解是指死细胞过多的情况下，RNA 会被RNA酶降解，但看了你得图, 如果1，2，4 没有被转染的话，则问题不是因为这种情况
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很高兴您还在关注这个帖子，再次感谢！
我还是根据您回复的顺序来回答吧。
1.我的细胞用24孔板培养，每次孔中长到85%的样子提RNA，两次细胞数量级都在10的5次方。前一次确实是看到了沉淀了的，以前的预实验也是看到了沉淀了的。前一次的沉淀溶解于10ul DEPC水后取4ul跑胶结果如图。右边提的细胞量为两孔，有点问题。
2.感谢您关于转染的建议，一个小问题：转染后改用含血清培养基培养，细胞重新增殖不是降低了转染效率吗？是不是能维持细胞存活同时又保持数量稳定的转染是最好的转染方案？ 我提取RNA一直用的是Trizol,提细胞的几次都没污染，但组织的几次都没提好，不知何故，您有什么好的建议吗？谢谢。
3.首帖打错字了，不好意思，已更正，1.2.4孔为转染了siRNA孔；谢谢您的建议，正在对提取步骤逐一排查。
4.没摇匀的可能性存在，以后注意。谢谢！
5.我就是提完做RT－PCR，您说的直接PCR内参基因是指提完RNA不检测RNA质量吗？
6.这句不太清楚。我提之前是PBS洗三次，洗掉死细胞和培养基。死细胞过多，它们释放的RNA酶会降解剩下的活细胞中的RNA（我理解错了没有）？还是说这些酶会降解转染的siRNA。


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发表于 2015-12-4 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Smile
1：24孔这个数量级提取RNA 是不应该看见沉淀的。但是对于转染，这个数量级是有些拥挤。我一般是用12孔。细胞数为 3* 10的5次方（不知你的细胞个体是不是很大）。所以即使加入10%FBS containing media 也不会太影响细胞增殖带来的对转染效率的影响。
2：在用Trizol 时，公司卖的Trizol 一般里面还有RNA酶抑制剂，所以不用担心死细胞所带来的影响（在死细胞不是特别多的情况下）只要转染后将孔内培养基去除干净就可以，没必要用PBS清洗。 上面第六条里说的是如果死细胞过多，则死细胞里的RNA 是已经降解的核苷酸，也会被Trizol　提取出来，但是因为是寡核苷酸，是你的提取产物里寡核苷酸增多，所以，影响你整体的ＲＮＡ的质量。在从组织中提取时，首先，速度要快（快速挪移到Ｔｒｉｚｏｌ里）你也可以在Trizol 状态下 homogenize (
最好用DEPC-DW 处理一下homogenizer ） 另外，Trizol
量要足够多。可参考datasheet上面的protocol
3: 如果为了RT-PCR 没必要进行RNA 质量检测，这样比较浪费RNA 因为RT-PCR 本身就是以各粗略的检测， 即便RNA 质量不是特别好，也能p 出来。在进行RNA 定量时，
A260/A280 大于1.5 就可以，好一点的在1.7~1.8 之间。若超过2.0 则说明RNA 降解严重。若低于1.5 则说明蛋白质污染严重。
我可以发给你一个我用过的protocol 你可以参考一下
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发表于 2015-12-4 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一句，不知道你的溶胶是百分之几的。因为如果在1~2% 之间，你的2孔的最上方
well（点样孔？）亮度太大，证明有大分子物质，所以很可能是大分子DNA
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发表于 2015-12-4 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RNA 提取
以12孔为例
1， 吸干培养基（用pipette).加Trizol 500ul,pippeting 数次，然后室温放置5分钟左右（使核苷酸分子从 核苷酸-蛋白质复合物 充分的分离出来，而不夹带蛋白质
以下步骤在ice 上进行
2， 加入chloroform 150ul 混匀，在ice上放置2分钟左右，
3， centrifuge at 12000rpm 4摄氏度 for 10 mins
4, 取上清液(检查上清液是否澄清，浑浊的话 重复3） 并加等量isopropyl alcol 混匀，在ice 放置15mins
5, centrifuge at 12000rpm 4摄氏度 for 15mins
6, 加70% ethenol and centrifuge for 5mins at 7500rpm 4 摄氏度
7，自然空干。加入DW 20ul 并在70度 水浴加热5分钟，在ice
冷却5分钟。
8，RNA 定量取1~4ul 进行定量。A260 不得超过1 ( 超过的话，不是直线方程，容易产生误差，可在稀释。正常应该是大于0.1 小于 0.6)
9, 取1ug RNA 进行 RT. (20ul 体系）
10, 进行PCR。 分三组。 1 negative control: 模板为RNA，2， positive control：模板为 cDNA， 1，2 引物都用内参基因的。 3。 目的基因。模板-cDNA 引物为目的基因的。
希望能对你有帮助。
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发表于 2015-12-4 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前几天再用24孔板等量重新传板，长至90%左右，三孔重提细胞总RNA，三孔用于转染。前三孔仍然可看到清晰沉淀。转染的三孔无血清培养24小时后（中间12小时换液）提RNA，仍然看不到沉淀（都是用Trizol法提取）。跑胶如图。令人惊讶的是这个图与上一次的表现惊人的一致：添加了转染试剂的有两条带，未添加转染试剂的只有一条带。(图中Marker为DNA Marker.)
原因到底在哪：1.无血清培养细胞生长分裂活动减少，RNA量也随之减少？
2.操作上，酒精洗涤后晾干太慢，就放到60度烘箱里烘干，莫非是这里出了问题？
园子里很多这方面的高手，急切想听听你们的看法.


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sunbent[使用道具]
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 小中大

很有意思， 只可惜我的建议好像没帮到你，帮你顶一下，希望大家好好分析分析。
可是我看第三组还是有的， 好像28s 消失了吧, 你没有POSITIVE control 吗？
我这周日也要做转染（用Lipofectamin )，然后PCR, 我做完，我们再好好讨论
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