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标题:【求助】引物验证

mogu[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】引物验证

我用primer 5.0设计了PAG608基因的引物序列，上游引物为 5'-TCGGGTTGGACTGACTTT-3' 下游引物 5'-GTGAGGGCTGCTTAGGTG-3'，PAG608的CDS序列见附件。在上海生工进行引物合成，现PCR一直不出带，请大家帮忙分析是否为引物设计方面的原因，谢谢！
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2015-12-4 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的上游引物GC含量为40%,下游为61％。一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。但有时虽然这样，也可出来结果，我觉得还要先看看你的体系是否有问题，beta-actin已经出来了么？如果没有问题，在低于引物合成公司提供的TM值4度，试试！
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发表于 2015-12-4 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

经OLIGO评价：你的上下游引物的各项指标都还不错，应该不是引物的问题，你可以从其他方面考虑一下：
1、在你所用实验组织或细胞中有没有这个基因的表达？
2、所提RNA的质量如何？是否尽量避免了RNA酶的污染？
3、内参能否做出来？如果内参能做出来，说明体系没问题。
4、反转录酶是否有效。
5、PCR的退火温度在60℃上下试试。


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2015-12-4 16:00
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ero11[使用道具]
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发表于 2015-12-4 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的RNA 和反应体系应该没问题，内参出的比较好，只是PAG608目的带一直不出。谢谢大家帮忙分析，也盼望有更多人继续指点。我会按照qiji314和1world1dream 的指点先尝试一下，但愿能有好结果啊
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发表于 2015-12-4 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你是如何分析这些引物的, 在基因上找这些引物的位置很麻烦, 是不是可直接输入这些引物在做分析, 请赐教.本人刚学设计引物,是菜鸟一个,
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mogu[使用道具]
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发表于 2015-12-4 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
虽然你没问我，看见高手不在，我先说一下我的做法。
我是把查到的基因CDS序列放到word文档中，先用查找替换，把其中的数字和空格都去掉，成为连续的碱基符号队列。然后再在这个连续的碱基符号队列中查找你的引物，其中上游引物直接查找，下游引物反向互补后再查找，查找完毕用word中的字数统计就可以知道你的引物所在的位置了，进而可以在软件中进行分析。
这个办法比较笨，但是因为没人指导，目前位置我就摸索出这么一种方法，操作起来也不是太麻烦，你可以在高手指导前先试试Smile
直接输入引物序列的分析方法我还没有用过，期待楼上站友能传道授业解惑，我和楼上就一起受益了。
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发表于 2015-12-4 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了这样的问题，PCR一直没有片段出来，我们实验室里的一个同学也没P出来．我在生工合成的引物Tm是６５度，先用６０度作为退火温度，没有．我又降到了５７度，还是没有．重新稀释了引物，没出来．加大了模板和引物以及酶量，还是没有．而我的内参扩出来了的．怕延伸时间不够又延长了时间，没有．真的是非常之郁闷！！救救我吧．（我的片段长２kb）另附我的引物，望大家指教，帮助．
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 小中大
我是用OLIGO软件分析评价的，把查到的基因CDS序列复制粘贴到软件中即可，不用把其中的数字和空格都去掉，软件可直接识别序列而忽略数字和空格，然后用OLIGO软件的search---- "for a sequence string" ---- "±/＝strand" ；把上游或下游引物序列粘贴到对话框中，即可在基因序列中查找了，找到后，再用analyze 功能进行评价。想找到一个比较合适的引物实在太难了（也可能是我太笨了），为战友分析评价一个引物都会占用我很多时间，每次我都想，再不看引物的帖子了，面对战友的求助，真是于心不忍，而版主还有点吝啬分数，我的辛苦他能理解吗？我不求什么，只想给我加点辛苦分就足矣。
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发表于 2015-12-4 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用primer 5.0设计了PAG608基因的引物序列，上游引物为 5'-TCGGGTTGGACTGACTTT-3' 下游引物 5'-GTGAGGGCTGCTTAGGTG-3'，PAG608的CDS序列见附件。在上海生工进行引物合成，现PCR一直不出带，请大家帮忙分析是否为引物设计方面的原因，谢谢！

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我也是新手，刚做RT-PCR。目的基因、β-actin都没做出来。我用oligo分析了一下你的引物，其它的都很好。就是Analyze》PCR的时候提示“Excessive difference between product and primer melting temperatures.”，Help里面提到 产物引物Tm差值不要太大，会导致模板-模板、引物-模板之间退火发生竞争。当上下游引物浓度各为200nM时，Tm差值为28.4【一般不要超过20】。当上下游引物浓度都提高到1uM时，Tm差值为25.4。所以我觉得是你的引物问题。另外不知道你用的引物终浓度是多少？
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mogu[使用道具]
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 小中大
我用primer 5.0分析上下游引物Tm之间只差0.5度，1world1dream用oligo分析的结果是上下游引物Tm之间差0.4度（如上），不知道你分析得结果是相差多少？怎么得来的？我用的引物终浓度是多少我忘了，就是用上海生工的引物说明书上规定体积的双蒸水来溶解引物干粉，到用时按照1：10稀释，25ulPCR体系中上下游引物各加了1.25ul，最终浓度我明日查阅实验记录再告诉你。多谢交流：）
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