【求助】如何选择最佳引物?

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】如何选择最佳引物?

14 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】如何选择最佳引物?

yonger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2015-12-4 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人要用PCR检验一个基因mRNA的表达，用primer5设计引物,根据primer的搜索功能分别搜索到100条正义链、反义链的引物及引物对，那么如何选择最佳的引物呢？是否应选评分最高的引物对呢？另外，如果文献报道的引物与搜索出的最佳引物不符，又该应该选择哪一个呢？

sunnyB[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77335
精华 0
积分 581
帖子 862
信誉分 100
可用分 5059
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态离线

发表于 2015-12-4 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你是用primer软件来设计引物，一般情况下，打分最高的引物是最合适的引物。因为你只是检测基因的表达情况，所以只是能扩增出合适长度的片段就行了。
当然，如果有文献报道的引物，那当然用文献的，因为那是经常实验验证的，肯定是没有问题。

9900[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2015-12-4 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

1. 如果文献已报道了引物，那就用文献上的引物就行了。不过，为了保险起见，你最好还是将文献报道的引物与目的基因序列比对一下，看是否完全符合，因为有的文献上报道的引物有1或2个碱基是不匹配的（可能是校稿疏忽或者是作者故意的吧）。
　对于上游引物（其序列与目的基因序列上的一段相同），直接用其序列在目的基因序列里查找就行了，如能找到那就没问题；如果找不到就减少3’端的几个碱基再查找，直到找到为止，然后根据目的基因序列将引物序列中不正确的碱基改过来。例如，如果文献提供的上游引物序列为5‘-GGAATCCTACCTTGCAAGCA-3’，而目的基因序列上相对应的序列为5‘-XXXXXXGGAATCCTACCTTTCAAGCAXXXXXXX-3’，用整个上游引物序列当然不能在目的基因序列上找到相应的片段，那就用5‘-GGAATCCTACCT-3‘再找，找到后，将文献提供的上游引物序列改为5‘-GGAATCCTACCTTTCAAGCA-3’就行了。
　对于下游引物，先把其序列转换为其互补序列再用互补序列查找，比如，下游引物序列为5‘-ATCCCTGAAGGTGGTAACGG-3’，那它的互补序列为5‘-CCGTTACCACCTTCAGGGAT-3‘。
2. 如果自己用软件设计引物，当然应在评分高的引物中选。但同时也应注意以下几点：
　引物的Tm值：引物的Tm值不能太低也不能太高，在45-60度之间比较合适；两条引物的Tm值应尽可能相等或接近，最好相差不超过5度。
　引物的碱基分布：避免连续出现4个以上的同一碱基。各种碱基最好分布均匀，G+C/A+T应为50%左右。
　引物的内部稳定性：引物的3‘端应选用A、T，少选用G、C，这种引物有更高的引发效率，且能有效地避免假引发（false priming）；当然，如果实在没有这种引物，3’端为G、C的也可以。
　引物二聚体及二级结构：尽量避免在两引物分子之间或一引物分子内部有过多的互补碱基，尽量避免引物分子内部二级结构（即通常所说的发夹结构）的形成；如果很难避免，那也要尽可能避免在引物3‘端出现二级结构，因为3’端有二级结构的引物是不能有效引发延伸的。

PINK[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 73133
精华 0
积分 418
帖子 536
信誉分 100
可用分 3488
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-19
状态离线

发表于 2015-12-4 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢指点。只是我越来越糊涂了。既然引物是按互补配对原则设计的，为什么会与某一段序列相吻合而非互补？

9900[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2015-12-4 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看下图就明白了（主要看第一、二循环；其中，5‘和3’标在两端的为模板）。
引物是按互补配对原则设计的。第一个循环时，下游引物与cDNA互补配对；第二个循环时，下游引物仍与cDNA互补配对，而上游引物则与第一个循环新合成的链（cDNA的互补链）互补配对。
而Genebank提供的、你作为模板设计引物的mRNA实际上是以mRNA为模板反转录所获得的cDNA。所以，上游引物肯定是与你的目的基因序列上的一段相同的，而下游引物则与目的基因上的某一段互补。

附件

2015-12-4 16:38

13641795.jpg (46.8 KB)

whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态离线

发表于 2015-12-4 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
我相信你说的是对的,因为我已经按照你给出的方法验证了许多对引物,只是我还是不理解,Genebank上给出的序列怎么是cDNA序列?
以下是我从Genebank上下载的有关这个基因的部分内容：.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2357
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/chromosome="2"
/map="2q37"
gene 1..2357
/gene="UGT1A1"
/note="synonyms: GNT1, UGT1, UDPGT, UGT1A, UGT1*1,
HUG-BR1"
/db_xref="GeneID:54658"
/db_xref="LocusID:54658"
/db_xref="MIM:191740"
CDS 16..1617
/gene="UGT1A1"
/EC_number="2.4.1.17"
/note="bilirubin UDP-glucuronosyltransferase isozyme 1;
go_component: microsome [goid 0005792] [evidence IEA];
go_component: integral to membrane [goid 0016021] [evidence IEA];
go_function: glucuronosyltransferase activity [goid0015020] [evidence IEA];
go_process: metabolism [goid 0008152] [evidence IEA];
go_process: digestion [goid 0007586] [evidence NR] [pmid1898728];
go_process: estrogen metabolism [goid 0008210] [evidence TAS] [pmid 8780690];
go_process: bilirubin conjugation [goid 0006789] [evidence TAS] [pmid 1339448]"
/codon_start=1
/product="UDP glycosyltransferase 1 family, polypeptide A1 precursor"
/protein_id="NP_000454.1"
/db_xref="GI:8850236"
/db_xref="GeneID:54658"
/db_xref="LocusID:54658"
/db_xref="MIM:191740"
ORIGIN
1 aggagcaaag gcgccatggc tgtggagtcc cagggcggac gcccacttgt cctgggcctg
61 ctgctgtgtg tgctgggccc agtggtgtcc catgctggga agatactgtt gatcccagtg
121 gatggcagcc actggctgag catgcttggg gccatccagc agctgcagca gaggggacat
181 gaaatagttg tcctagcacc tgacgcctcg ttgtacatca gagacggagc attttacacc
241 ttgaagacgt accctgtgcc attccaaagg gaggatgtga aagagtcttt tgttagtctc
301 gggcataatg tttttgagaa tgattctttc ctgcagcgtg tgatcaaaac atacaagaaa
361 ataaaaaagg actctgctat gcttttgtct ggctgttccc acttactgca caacaaggag
421 ctcatggcct ccctggcaga aagcagcttt gatgtcatgc tgacggaccc tttccttcct
481 tgcagcccca tcgtggccca gtacctgtct ctgcccactg tattcttctt gcatgcactg
541 ccatgcagcc tggaatttga ggctacccag tgccccaacc cattctccta cgtgcccagg
601 cctctctcct ctcattcaga tcacatgacc ttcctgcagc gggtgaagaa catgctcatt
661 gccttttcac agaactttct gtgcgacgtg gtttattccc cgtatgcaac ccttgcctca
721 gaattccttc agagagaggt gactgtccag gacctattga gctctgcatc tgtctggctg
781 tttagaagtg actttgtgaa ggattaccct aggcccatca tgcccaatat ggtttttgtt

whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态离线

发表于 2015-12-4 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

841 ggtggaatca actgccttca ccaaaatcca ctatcccagg aatttgaagc ctacattaat
901 gcttctggag aacatggaat tgtggttttc tctttgggat caatggtctc agaaattcca
961 gagaagaaag ctatggcaat tgctgatgct ttgggcaaaa tccctcagac agtcctgtgg
1021 cggtacactg gaacccgacc atcgaatctt gcgaacaaca cgatacttgt taagtggcta
1081 ccccaaaacg atctgcttgg tcacccgatg acccgtgcct ttatcaccca tgctggttcc
1141 catggtgttt atgaaagcat atgcaatggc gttcccatgg tgatgatgcc cttgtttggt
1201 gatcagatgg acaatgcaaa gcgcatggag actaagggag ctggagtgac cctgaatgtt
1261 ctggaaatga cttctgaaga tttagaaaat gctctaaaag cagtcatcaa tgacaaaagt
1321 tacaaggaga acatcatgcg cctctccagc cttcacaagg accgcccggt ggagccgctg
1381 gacctggccg tgttctgggt ggagtttgtg atgaggcaca agggcgcgcc acacctgcgc
1441 cccgcagccc acgacctcac ctggtaccag taccattcct tggacgtgat tggtttcctc
1501 ttggccgtcg tgctgacagt ggccttcatc acctttaaat gttgtgctta tggctaccgg
1561 aaatgcttgg ggaaaaaagg gcgagttaag aaagcccaca aatccaagac ccattgagaa
1621 gtgggtggga aataaggtaa aattttgaac cattccctag tcatttccaa acttgaaaac
1681 agaatcagtg ttaaattcat tttattctta ttaaggaaat actttgcata aattaatcag
1741 ccccagagtg ctttaaaaaa ttctcttaaa taaaaataat agactcgcta gtcagtaaag
1801 atatttgaat atgtatcgtg ccccctctgg tgtctttgat caggatgaca tgtgccattt
1861 ttcagaggac gtgcagacag gctggcattc tagattactt ttcttactct gaaacatggc
1921 ctgtttggga gtgcgggatt caaaggtggt cccacggctg cccctactgc aaatggcagt
1981 tttaatctta tcttttggct tctgcagatg gttgcaattg atccttaacc aataatggtc
2041 agtcctcatc tctgtcgtgc ttcataggtg ccaccttgtg tgtttaaaga agggaagctt
2101 tgtaccttta gagtgtaggt gaaatgaatg aatggcttgg agtgcactga gaacagcata
2161 tgatttcttg ctttggggaa aaagaatgat gctatgaaat tggtgggtgg tgtatttgag
2221 aagataatca ttgcttatgt caaatggagc tgaatttgat aaaaacccaa aatacagcta
2281 tgaagtgctg ggcaagttta ctttttttct gatgtttcct acaactaaaa ataaattaat
上面指出cDNA序列是16......1617这一段序列,难道这一段origin
序列全是cDNA序列吗?如果是这样,那么我们作RT-PCR时,是不是要根据它的互补序列设计引物?怎么没见引物设计原则上提醒这一点呢?模板弄反了,麻烦可就大了!呵呵呵!

9900[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2015-12-4 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

16----1617是CDS，即编码整个蛋白的编码序列（coding sequence）。
关于Genebank上提供的mRNA序列都是cDNA，我也是听师兄们讲的。从序列组成来看，mRNA序列里应该有U，而Genebank提供的序列中都没有U，而取而代之的是T，从这点来讲，是cDNA序列应该没错。从已发表的文献来看，RT-PCR引物的设计都是以Genebank提供的mRNA序列为模板；而从原理上讲，以Genebank提供的mRNA序列为模板设计引物进行RT-PCR，PCR产物连入表达载体，表达载体在细胞内转录产生mRNA，也就是说，表达载体在细胞内转录产生的mRNA和PCR产物（即Genebank所提供mRNA序列的一部分）是互补配对的。这些都说明Genebank所提供的mRNA序列应该是cDNA。
而我们在作RT-PCR时，是先用反转录酶将提取的mRNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，用所设计的引物扩增获得所需基因片段。因此，设计RT-PCR引物应以Genebank提供的mRNA序列为模板。你既然已经作过序列比对，那你应该清楚用于比对的序列是不是Genebank提供的mRNA序列了。

yonger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2015-12-4 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

真是佩服之极!不过我一开始并不是认为上述序列是mRNA序列,而是DNA(即基因序列),里面还应包含内含子.我有的同学作PCR扩增某一个基因时,也用的是这种序列.难道Genbank上还有另外的渠道查出DNA序列吗?
另外,你说CDS是编码整个蛋白的序列又是什么意思?是不是意味着设计引物时应在此序列内设计?我听说引物设计的关键并不在于设计出的引物对引物设计原则的符合程度,而是在于克隆片断是否把一些关键的外显子全部钓出,说的是不是就是这个道理?

9900[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75149
精华 0
积分 399
帖子 478
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2015-12-4 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

16----1617是CDS，既是说从16开始每3个碱基组成一个三联密码子，每一个三联密码子编码一个氨基酸，其中，16---18是起始密码子ATG（从这开始翻译），而1615---1617是终止密码子（这里是TGA，翻译到此结束），而除16---1617之外的碱基是不编码蛋白的。
引物的设计原则是说如果能达到其原则当然就最好的，越符合原则的引物就越好，就越容易扩增出产物。实际上要达到其原则有时候是比较困难的，我们只能选择相对较好的。但是，如果引物选择不好，是很难扩出产物的，不仅浪费了时间和试剂，到最后还得重新选择引物。所以，在设计引物的时候，最好能选择最接近引物设计原则的，即选择最好的引物。我倒认为引物的选择是很关键的，如果引物不好，你再怎么样摸条件也是没法扩出产物的；相反，如果引物设计好了，往往一次就能出结果，根本就不用优化条件。
至于说克隆片段是否把一些关键的外显子全部钓出，那得看你的实验目的了，那只是一个设计引物位置的问题，只要稍加注意就OK了。就拿RT-PCR来说吧，如果你只是要检测目的基因的表达情况，由于是以Genebank提供的mRNA为模板，所以根本就不用限定引物的位置，只需要根据你对片段大小的要求、引物设计原则来选择引物，并用Blast搜索一下是否会扩增出同一物种的其他基因片段（即检测引物的特异性）；如果你的实验目的是构建表达载体，那就得限制引物的位置，只要所扩出的基因片段能包含整个CDS就行了（当然，也得检测引物的特异性；如果所扩出的片段能尽量小一点那就更好了，但也得包含整个CDS）。
而一个序列到底是mRNA还是DNA，你只需看看它的说明就知道了，上面都标明的了。如下面这两个，一个是mRNA序列，一个是DNA序列。
1: NM_008366. Reports Mus musculus inte...[gi:31982837] Links
　LOCUS NM_008366 939 bp mRNA linear ROD 22-NOV-2004
　DEFINITION Mus musculus interleukin 2 (Il2), mRNA.
　ACCESSION NM_008366 XM_207774
　VERSION NM_008366.2 GI:31982837
1: Z33178. Reports M.capricolum DNA ...[gi:541712] Links
LOCUS MC244 579 bp DNA linear BCT 19-SEP-1994
DEFINITION M.capricolum DNA for CONTIG MC244.
ACCESSION Z33178
VERSION Z33178.1 GI:541712
KEYWORDS ABC transporter (MDR subfamily).

14 1/2 1 2 ››