小中大【求助】关于简并引物PCR问题!
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小弟接触简并引物PCR已经有一段时间了,虽然说不上是老手,但是至少不是新手了,对于简并引物PCR有了初步的了解。在dxy里,看了很多这方面的帖子,逐步认识了这个试验。但是我在试验过程中发现,还是有很多的问题我解决不了,我曾经发过关于简并引物PCR的帖子,但是回答的人几乎没有,我不知道是这个试验本生就很难,还是什么别的,我反正觉得特难!
我的模板是细菌基因DNA,我用生工的UNIQ-10柱式kit,得到的基因组DNA是20kb左右,而且我用其他文献发表的用proteinK和SDS法,也是同样大小。由于有人说,至少是20kkb,所以我真是怀疑模板大小问题。但是抽提过程中,十分小心,不可能会出现断裂,电泳宣示十分好! 我在简并引物PCR时,模板一般是200ng左右。
我用了保生的PCR酶rTaq,很常规的酶。50微升的体系,5微升的buffer,其中已经有镁离子了。dNTP是4微升,引物浓度为1微摩尔。引物如下:
上游引物:
Maltooligosyl trehalose synthase (MTSase):
Primer1:上游引物:THDTKR
5‘-AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCG(C/A/G)-3’
说明如下:为了降低引物的简并性,并且3‘端不能有简并性,故对于3‘端我拆分开来,具体见下:
1.5‘-AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGC-3’
2.5‘-AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGA-3’
3.5‘-AC(G/C)CACGA(T/C)AC(G/C)AAGCGG-3’
引物 长度 GC含量 退火温度
5‘-ACGCACGATACGAAGCGC-3’ 18 61 53
5‘-ACGCACGATACCAAGCGC-3’ 18 61 53
5‘-ACGCACGACACGAAGCGC-3’ 18 67 55
5‘-ACGCACGACACCAAGCGC-3’ 18 67 55
5‘-ACCCACGATACGAAGCGC-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGATACCAAGCGC-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGACACGAAGCGC-3’ 18 67 55
5‘-ACCCACGACACCAAGCGC-3’ 18 67 55
5‘-ACGCACGATACGAAGCGG-3’ 18 61 53
5‘-ACGCACGATACCAAGCGG-3’ 18 61 53
5‘-ACGCACGACACGAAGCGG-3’ 18 67 55
5‘-ACGCACGACACCAAGCGG-3’ 18 67 55
5‘-ACCCACGATACGAAGCGG-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGATACCAAGCGG-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGACACGAAGCGG-3’ 18 67 55
5‘-ACCCACGACACCAAGCGG-3’ 18 67 55
5‘-ACGCACGATACGAAGCGA-3’ 18 56 50
5‘-ACGCACGATACCAAGCGA-3’ 18 56 50
5‘-ACGCACGACACGAAGCGA-3’ 18 61 53
5‘-ACGCACGACACCAAGCGA-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGATACGAAGCGA-3’ 18 56 50
5‘-ACCCACGATACCAAGCGA-3’ 18 56 50
5‘-ACCCACGACACGAAGCGA-3’ 18 61 53
5‘-ACCCACGACACCAAGCGA-3’ 18 61 53
下游引物:
Maltooligosyl trehalose trehalohydrolase(MTHase)
Primer2:DVVYNH
5’-GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)AC(A/G)TC-3’
1.5’-GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)ACATC-3’
2.5’-GTGGTTGTA(G/C)AC(G/C)ACGTC-3’
引物 长度 GC含量 退火温度
5’-GTGGTTGTAGACGACATC-3’ 18 50 48
5’-GTGGTTGTAGACGACGTC-3’ 18 56 50
5’-GTGGTTGTAGACCACATC-3’ 18 50 48
5’-GTGGTTGTAGACCACGTC-3’ 18 56 50
5’-GTGGTTGTACACGACATC-3’ 18 50 48
5’-GTGGTTGTACACGACGTC-3’ 18 56 50
5’-GTGGTTGTACACCACATC-3’ 18 50 48
5’-GTGGTTGTACACCACGTC-3’ 18 56 50