【求助】彗星实验

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标题:【求助】彗星实验

fklo83[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠：
我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？
1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来的，我怕脱胶，是把玻片放在搪瓷盘中水平裂解、中和的。听说有人是放在染色缸里垂直的都不会脱胶，我真愁死了，请教大侠载玻片规格磨砂程度，在哪里买的，盖玻片规格呢？裂解、电泳、中和的细节问题能否给点指导呢？能够得到您的帮助将非常感谢！

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

脱胶问题确实常见，我的经验是要用新鲜配置的琼脂糖，玻片就是普通规格，可以自己磨沙或找厂家订做，盖片好象是24x的吧，一定要处理干净。实在不行第一层可以用推片（滴上胶用另一块玻片均匀推开），这样可以确保不掉片。

iii_ii[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

①磨砂玻片我们是找厂家定做的（单面全磨砂的那种，因为我们这里一般的载玻片上就有一面有五分之一的磨砂，因此我们要求厂家按照那五分之一的磨砂程度将载玻片的一面全部制成磨砂的）；盖玻片就是一般的盖玻片－－你若在上海的话，我们倒是可以帮你定一点的（那家厂商定期来我们实验室）
②裂解液与电泳液的pH值很重要；解决脱胶最关键的是要在4℃条件下进行裂解、解螺旋及电泳
③个人的一点解决脱胶的经验：铺胶前干烤一下磨砂玻片（42℃左右）；趁热铺胶（37℃左右）；每层胶都要在4℃条件下固化（大概5分钟左右）
④楼上所述也很有效，用推片的方法在一般的载玻片上或磨砂玻片上均匀的推上一层胶也能很好的避免脱胶
最后祝你好运！

summerxx[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上讲得很好，该注意的已经都提到了，你的问题也是我最初做时的烦恼，但是一句话：Practice makes perfect。相信经过一个阶段的摸索，你会掌握并应用得很好的。发一张我做凋亡的图。

附件

2015-12-10 11:51

37159713.snap.jpg (16.41 KB)

orangecake[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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我也来说两句：我们所用玻片和zhwang所说完全一样；我们在做的时候通常底胶浓度只有0.8-1%，趁热（玻片干预热约45度，正常熔点胶约55度）取50微升推片，凝固约5分钟，300微升铺片，加盖玻片，4度冷凝10分钟，接着去盖玻片，铺低熔点胶与细胞混悬液，加盖玻片（小心勿使有气泡），4℃冷凝10分钟，铺顶胶，再冷凝。如此铺片决不掉胶！保证你室温泡在水里一个小时都不掉！！！对了，你所用的是哪家公司的胶？强烈建议用进口胶，我们用PROMEGA公司的，效果相当好。祝你成功！！

sunnyB[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

彗星试验用什么电泳仪或者电泳槽比较好，我们做药物毒性的体内试验，每个动物要做100个细胞的电泳，每组至少5只动物，至少5个剂量组，这样至少要分析2500个细胞的电泳，每次电泳要至少20分钟，这样就要用好久的时间，请推荐几个比较好的电泳仪或者电泳槽，那种大通量的，谢谢……

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发表于 2015-12-10 11:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在好像磨砂片已经很难买到了我们实验室用的也是原来找玻璃厂自己加工的毛玻片用坏一张少一张所以一般也用的是光玻片我的经验是如果底层胶铺太厚就很容易托片试试用沾的方法

#甜#[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也要被开始做彗星实验，完全没有经验，正在买磨砂载玻片，可是请问各位大神怎么去除盖玻片啊，我去盖玻片的时候，胶都会跟着脱掉，郁闷啊，怎么办？

ero11[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在做彗星实验，就是各种脱胶，而且制完胶之后，盖上盖玻片，4度固化30min后，取掉盖玻片，会有很大的水汽。再盖上第二层胶的时候，取掉盖玻片，即便是侥幸不脱胶，等着一裂解，就又开始脱胶，直接就变成有的载玻片上什么都没了。这现在到底是怎么回事呀，着急呀，快愁死我了

PINK[使用道具]
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发表于 2015-12-10 11:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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