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标题:【求助】关于检测细胞内ROS的荧光染料DCFH的实验方法问题

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发表于 2015-12-12 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面是染毒组


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发表于 2015-12-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么是发红色荧光呢？应该是蓝光激发，发射出绿色荧光啊
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发表于 2015-12-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的用蓝光激发看不太清楚~但是用绿光激发，红色的荧光看的很清楚~
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发表于 2015-12-12 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那可能不是dcfh的荧光，激发波长不对不能产生发射光，其它朋友的意见呢？
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发表于 2015-12-12 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天重做，增大dcfh剂量，有绿色荧光了~下面是对照


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 小中大

下面是染毒了的。不过看片子之前没有用pbs洗，背景不是很好~


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发表于 2015-12-12 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天又做了一次，加药物处理3个小时，换新鲜培养基后12小时，然后在培养基中加入dcfh ，终浓度10uM，37度30min，胰酶消化收集细胞后，pbs洗一次，制成pbs悬液，在荧光光度计上检测，结果还是没发现荧光峰，真是郁闷，不知道是什么地方出了问题，难道是药品的问题？或者是不能在培养基中直接加入dcfh？
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发表于 2015-12-12 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么药物处理3小时后还要换新鲜培养基12小时，不过好象ROS 的确不容易测，我是用酶标仪测的，摸了很多条件还搞不定，如果楼主成功了，希望能分享一下你的经验，祝好运！
对了，你们用荧光分光光度计测能做到量化吗，浓度组间怎么区分呢！
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发表于 2015-12-12 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用荧光光度计做了2次，结果还可以，平行样之间差异比较小，处理组的荧光强度大概是对照组的两倍，考虑到处理组细胞量要少些，它们之间的差异应该更大。不过定量确实是个问题，我是测定细胞的总蛋白量来定量，但是感觉这个方法误差比较大。
还是用流式做最好。
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发表于 2015-12-12 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有用过荧光分光光度计测DCFH荧光强度的朋友，交流些经验啊

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不用裂解细胞，我问过碧云天试剂公司了。我们做过了荧光酶标仪，跟分光光度计差不多的。
我今天做了一次就按其说明书做的，但最后一步用PBS洗3遍，洗掉探针，好像比以前结果好。我们也在摸索中，欢迎指正！
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