扫描电镜之家

我最近用脱钙骨基质支架材料体外培养骨髓基质干细胞细胞，做了扫描电镜不知是不是细胞？请大家看看是什么地方出现了问题？
细胞培养步骤：
1：脱钙骨基质75%酒精浸泡过夜；PBS清洗5min *3次；完全培养基浸泡过夜；
2: 骨髓基质干细胞1*106/ML密度接种，每个接种100微升
3：培养箱中静置4小时
4：加入完全培养基1ml，继续培养4天

扫描电镜步骤：
1：取出支架，PBS冲洗
2: 3.5%戊二醛固定4小时
3: 30%、60%、70%、80%、90%、100%叔丁醇梯度脱水，每个梯度10分钟。
4: 真空干燥，置样，喷金，扫描

看文献上的图片，放大倍数在300倍左右就可见明确的细胞形态，但我的实验结果不能判断是不是细胞生长。
请大家看看是什么地方出现了问题？

前段时间做这部分实验，按照同样的接种及固定方法，电镜扫描支架上未见任何细胞生长。分析原因：可能是支架制作过程中，丙酮、乙醚、盐酸成分残留，细胞毒性作用导致细胞死亡。下图是第一次SEM结果

本次试验，重新制作了支架材料，使用丙酮、乙醚、盐酸后都反复用水清洗，并测试保证PH值在7.0左右。
自己分析结果：
1：如果脱钙骨基质上是细胞，可能问题出在固定或脱水环节；其中脱水步骤中叔丁醇脱水时间是不是恰当（每个梯度10分钟）？梯度叔丁醇配方是否正确（比如70%叔丁醇配方为：70体积叔丁醇，30体积纯水； 但是有的文献上说是70体积叔丁醇，30体积酒精）？
2：如果脱钙骨基质上不是细胞，那么支架上的絮状物可能是叔丁醇的结晶物？细胞在支架上不生长，可能的问题还是出在支架材料上，可能还有毒性残留。

建议电镜观察细胞种的稀一点，第二次的很像细胞，可能太密没办法看清细胞结构和边界，固定时间长点，脱水动作轻柔点，一般没问题

3.5%的戊二醛好像有点高吧，0.5%-1%即可，固定可过夜，乙醇脱水即可，每个梯度1h

、用生理盐水或PBS漂洗复合物
2、用2%的戊二醛固定15min，固定温度：4℃
3、0.1mol/L的pbs清洗三次、每次5-10min
4、1%的锇酸固定1h，固定温度：4℃
5、0.1mol/L的pbs清洗三次、每次5-10min
6、梯度乙醇脱水，每次5min（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，100&的脱两次）
7、干燥。最合适的干燥方法是“临界点干燥”，但是一般环境中没有“临界点干燥仪”。其他的有真空冷冻干燥、真空干燥、自然空气干燥等。
再就是喷金 扫描了。