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标题:请教:RNA提取和RT-PCR

园丁##[使用道具]
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谢谢大家的关心!
我用的是RNA提取试剂盒。
昨天做了RNA电泳,没有RNA的三条代出现;今天又重新提取RNA(Tip头全重新用DEPC泡了,并高温消毒),并和以前有产物出现的RNA(保存于-70度,1 week)跑RNA电泳,都没有RNA三条代出现。(没有做RT-PCR)
现在考虑RNA试剂盒有问题,打算明天提取正常组织的RNA,看究竟是否有RNA提取出来。
你们觉得呢?
现在真是心力憔悴呀!
谢谢大家!
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园丁##[使用道具]
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另外,我做RT-PCR是用的PCR仪(以前做出来过,应该RT-PCR过程没有问题),RNA提取过程也严格按照试剂盒说明书做的。
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园丁##[使用道具]
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RT-PCR也是用的试剂盒(大连宝生物公司)
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园丁##[使用道具]
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14
 
更详细的过程是:

试剂:RNA提取试剂盒(Promega公司)
RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)
PCR仪
过程:2004年3月12日-2004年3月22日
提取昆明鼠皮肤移植物RNA(组织大小约1cm×1cm):液氮冻存10min,取出,碾钵碾磨,然后按照试剂盒说明书进行操作,测OD值,做RT-PCR,跑电泳,收集图像。
结果:有RNA提取出来,RT-PCR有结果
2004年4月2日-2004年4月7日
提取Balb/c→C57皮肤移植物(术后1天)RNA,步骤同前(260nm OD值 /280nmOD值=2.0),结果查见没有β-actin的条代出现(有RT-PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现);将RNA提取物直接跑RNA电泳(电泳槽、电泳液等全部用DEPC处理),没有RNA的三条代出现。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物(术后3天)RNA,步骤同前(260nm OD值 /280nmOD值=2.4),并与术后1天标本同时做RT-PCR,结果同前,(没有β-actin的条代出现,有RT-PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现)。跑RNA结果同前(没有RNA的三条代出现)。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物(术后5天)RNA,步骤同前(但是没有测OD值和做RT-PCR),直接跑RNA电泳,没有RNA的三条代出现。
提取昆明鼠正常新鲜皮肤,步骤同前(没有测OD值),跑RNA电泳,没有RNA的三条代出现;做RT-PCR,有β-actin的条代出现。

现在考虑实验组没有RNA的缘故是组织细胞量太少,而正常组织的细胞量多故能够提取出来RNA。
请问是不是呢?
谢谢大家!
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mimili_901[使用道具]
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RT我已经做了7年了。成功率现在为100%。现在建议如下:
1 一次性的耗材如果包装完整,没有必要进行灭RNA酶的处理。
2 楼上的朋友说的很对,速战速决很重要。
3 不要太担心RNA降解,尽量减少将标本置于37度左右温度环境。
4 RT过程中的RNA的变性很重要,置于冰水中的速度要快。其作用为打开RNA的二级结构。
5 PCR的反应条件很重要。如果上下游引物的TM值相差较远,可用touchdown的方法来做。
6 从你说的情况来看,RNA的降解并不是主要问题。
7 如果仍有问题,可将实验过程描述详细一点,我将尽快回答。

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对于第一条,想请问那种国产的有塑料扣封口的器材(包装完整)也可以不进行DEPC处理吗?
第四条,如果使用一步法试剂盒,是不是就不用考虑了?
我也是新手!不出结果!
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花裙子[使用道具]
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你上面说:
从RNA抽提,到RT,到PCR要一路做下来,别停,甚至可以不用测CD,更何况说RNA电泳.就是其他的战友说的那样要速战速决.RNA电泳看起来降解了,很多时候也可以作出RT-PCR的.
这听起来很有道理!可如果不测OD,那RT-PCR反应体系中模板浓度怎么定呢?具体加多少样本呢?  
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碧空子[使用道具]
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最近我提了200多份组织RNA,算是有点经验了。我的标本一般离体后1~2小时内置于RNAlater中浸泡过夜,取出后置于-80度冰箱保存(一年都没关系)。用Invitrogen生产的Trizol抽提,方便又简单,这中间RNA沉淀后可保存于75%的DEPC水处理的乙醇置于-20度近一年。但一旦水融解RNA后应尽快逆转录。融解后测一下OD比值和浓度。逆转录就采用PROMEGA的MMLV逆转录酶进行逆转录反应,还没做目的基因的PCR,但用看家基因试了一下,还不错。实验刚开始觉得很难,现在觉得就那么回事。RNA酶并没有想象的可怕。OD比值2.4就太高了,应该在1.8~2.0。  
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cute[使用道具]
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喵咪
看了你的回帖,受益非浅。您是RT高手,我现在也有这方面的问题特向你请教:我提脂肪组织RNA(用trizol法),但几次都未成功,非常希望得到您的帮助,不知可否将如何提脂肪组织的RNA的具体操作过程及注意事项发送给我,非常感谢!
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嗨皮[使用道具]
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我现在在做一种外来病毒的鉴定,因为是RNA病毒所以要用RT-PCR扩增特异的片段,引物我自己已经设计好了,那后续的工作怎么开展呢?
  请教这方面的高手指教.谢了!
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蝴蝶结子[使用道具]
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请教各位高手,我用 Invitrogen 的Trizol 和 Roche的 Tripure 提胎盘组织总RNA,共提了11次, 虽然产量和A260/A280都可以, 但RNA总有降解(18S的亮度超过28S,且18S以下有大片条带). 使用Promega的M-MLV用下游引物和Oligo dT逆转录的cDNA的分子量都在500bp以下(我的目的条带为2000bp左右), 用高保真Taq酶做 PCR的结果为500bp 以下的3条非特异性条带,改变模板浓度后仍未出现目的条带.
组织切下后即放入液氮,至今有2个月. 各种玻璃器皿和枪头都用DEPC浸泡过夜后高压灭菌. RNA提取后即逆转录,次日PCR.
真搞不懂问题在哪里.
渴望大家帮助!
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