小中大我做了脂肪组织RNA的提取，已经做了一个多月了，我用的是Qiagen mini kit，刚开始什么都做不出来，现在总算可以提出RNA了，但我不知道我提的RNA怎么样，附图（见附件），测了OD值为1.98,用的Qiagen的逆转录试剂盒做了逆转录,现在做pcr,只能扩出引物二聚体.
逆转录反应步骤如下:
RT反应:
注意：（1）对50ng～2ug RNA进行逆转录；
（2）将所有的反应在冰上进行，以防cDNApremature合成和减小RNA降解的危险。
（3）如果用oligo-dT引物,推荐用12个核苷酸,终浓度为1uM,当用随机引物时,推荐用9个核苷酸,终浓度为10uM.
操作步骤：
（1） 在冰上融解模板RNA。在室温（15～25℃）融解引物溶液（未提供），10×Buffer RT，dNTP Mix，无Rnase的水。融解后立即放在冰上。振荡器上振荡混匀，短暂离心以收集残留的贴壁的液体。
（2） 用冰冷的1×Buffer RT(用提供的Rnase-free水稀释10×BufferRT溶液获得)稀释Rnase inhibitor（未提供）到终浓度10 units/ul。振荡5s以下小心混匀，短暂离心以收集管壁残留的液体。
注：商品化的Rnase inhibitor一般是40 units/ul，稀释使下一步取少量的Rnase inhibitor时容易操作。要准备新鲜的Rnase inhibitor的稀释液。为了减少Rnase inhibitor和Buffer RT的用量，每次稀释不要超过逆的使用量。
（3） Reverse-Transcription Reaction Components
Component Volume/reaction Final concentration
Master mix
10×Buffer RT 2 ul 1×
dNTP Mix (5mM each dNTP) 2 ul 0.5 mM each dNTP
Oligo-dT18 primer(0.5ug/uL) 1.5ul
Rnase inhibitor(10 units/ul) 1ul 10 units(per 20 ul reaction)
Omniscript Reverse Transcriptase 1ul 4units (per 20 ul reaction)
Rnase-free water 6.5
Template RNA
Template RNA,added at step 5 7 Up to 2 ug(per 20 ul reaction)
Total volume 20 ul －
彻底混匀小心vortex不超过5s，短暂离心以收集试管壁上的残留液体，放在冰上。
注：如果有4ugRNA模板则将反应体积按比例扩大为40ul。
（4） 加入模板RNA，彻底混匀小心vortex不超过5s，短暂离心以收集试管壁上的残留液体。
（5） 37℃孵育60min。
（6）取出一定量的反应产物加入PCR反应。可在冰上直接进行PCR反应，或放入－20℃长期保存。
