小中大你的内对照β-actin都没有出现PCR产物。可见你以前每个环节包括RNA抽提,RT,PCR都有可能有问题。
我的建议是:
1.所有要用的器具都严格用0.1%DEPC处理.
2.从RNA抽提,到RT,到PCR要一路做下来,别停,甚至可以不用测CD,更何况说RNA电泳.就是其他的战友说的那样要速战速决.RNA电泳看起来降解了,很多时候也可以作出RT-PCR的.
3.有时要注意PCR的条件,可以用一个带有目的片段的质粒DNA作PCR的阳性对照。
总之,RT-PCR要保证3个环节的成功,即RNA抽提,逆转录和PCR.如果你这3个过程都设计好阴\阳性对照,问题就很容易找出来了.而且,等你做出结果后,你就成为RT-PCR高手了.