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标题:请问：有关RNA提取和RT－PCR

魔法师A[使用道具]
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发表于 2011-10-4 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上各位各抒己见，在下深表同意，有点点个人体会不妨跟大家共享，望批评指正。固然液氮保护下研磨是RNA不降解的最有力的保证，可是也有不易操作的缺点，就我做来的经验，一旦经液氮冷冻，组织就会变得坚硬无比，研磨起来颇有难度，而且尽管小心再小心，弄不好还是会碎屑飞溅，损失一些。或者是我操作的不对，因为一直以来本人都是摸着石头过河，没有机会观摩他人的操作，在这里如果能够得到哪位战友的指点，将不胜感激。言归正传，我认为是否有液氮保护可视组织的质地而定。比如，我第一次提取组织RNA遇到的就是硬骨头，没有办法，只好用液氮了，效果不错；后来轮到软的组织，也如法炮制，发现一旦入了液氮，竟然变得和骨头一样的坚硬，这样岂不是辜负了人家起初的天生软质，试着改成加入TRIzol后匀浆的办法，结果出来也很好，有图像为证（左为液氮法，右为改良法），而且提到的量也较多，主要是省事了许多。我们这里有人提取肾的RNA，不需液氮效果也不错。
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INK[使用道具]
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发表于 2011-10-4 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像对于肾脏、肝脏等软组织是可以不用液氮。
但我做的是皮肤呀？！只有用液氮咯？
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发表于 2011-10-4 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么非要用液氮研磨呢？需要说明的是液氮主要起快速冷冻的作用,RNA在低温时不降解!!!不论任何组织或细胞的提取液都不是液氮,而是Trizol。而且液氮确实不好研磨，蒸发快，所以不能保证RNA的不降解。所以个人认为最好的方法是组织（包括皮肤哦）直接在Trizol里研磨。接着继续进行抽提！
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发表于 2011-10-4 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

好像是降解了！
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发表于 2011-10-4 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
弱弱地问：trizol 是什么试剂？在RNA提取中起啥子作用啊？  
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发表于 2011-10-4 13:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也想请问trizol 是什么试剂？hansontcm战友所说的“Takara的Catrimox-14”又是什么试剂？它们都是提取RNA的试剂吗？那我用的Promega公司的RNA提取试剂盒，说明书上怎么没有提及“trizol 试剂”呢？哪位大哥可以给我解释一下，谢谢！

另外，我查找文献，发现好像没有谁用Balb/c的皮肤做过RT-PCR，不知道这是不是真的。请问有谁发现过这方面的文献吗？谢谢！
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发表于 2011-10-4 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“为什么非要用液氮研磨呢？需要说明的是液氮主要起快速冷冻的作用,RNA在低温时不降解!!!不论任何组织或细胞的提取液都不是液氮,而是Trizol。而且液氮确实不好研磨，蒸发快，所以不能保证RNA的不降解。所以个人认为最好的方法是组织（包括皮肤哦）直接在Trizol里研磨。接着继续进行抽提！”

好像说得有道理吔！
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发表于 2011-10-4 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也想请问trizol 是什么试剂？hansontcm战友所说的“Takara的Catrimox-14”又是什么试剂？它们都是提取RNA的试剂吗？

Takara的Catrimox-14是RNA Isolation Kit 中的一个组分，他是一种裂解液、还有变性的作用，有助于裂解细胞，同时Catrimox-14还可以结合RNA形成一种稳定的复合物，接下来除去不需要的物质，剩下Catrimox-14-RNA再从中提取RNA。trizol 也是一种裂解液，他是intrivogen公司的产品，非Promega产品。
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发表于 2011-10-4 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用Takara的Catrimox-14提贴壁细胞也没提出来，不过在原因未分析清楚之前我不想随便臧否Takara的产品，毕竟以前用过不少Takara的产品都还是不错的。

我是这样操作的：先用胰酶将细胞消化下来，用PBS洗涤后，去掉PBS，加入Catrimox-14，可是在加LiCl之前就没看到沉淀，因为在加入LiCl之前DNA及各种杂蛋白都还在，应该能看到沉淀的。逆转录PCR没P出来，但是对照RNA P出来了，说明逆转录和PCR都是没问题的，唯一的问题就是RNA没提出来。

提RNA的操作和所用的枪头管子都没有问题的，因为我又不是第一次提了，我不知道是不是不应该用胰酶消化，因为TRIzol的说明书上说提贴壁细胞时先倒掉培养液，然后直接将TRIzol加到瓶子里裂解细胞。

还请有经验的兄弟看看我的分析有没有道理啊！
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发表于 2011-10-4 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"Takara的Catrimox-14是RNA Isolation Kit 中的一个组分，他是一种裂解液、还有变性的作用，有助于裂解细胞，同时Catrimox-14还可以结合RNA形成一种稳定的复合物，接下来除去不需要的物质，剩下Catrimox-14-RNA再从中提取RNA。trizol 也是一种裂解液，他是intrivogen公司的产品，非Promega产品。 "

那Promega用的又是什么呢？I don't know.
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