小中大长PCR疑难问题
长PCR疑难问题
我第一次做PCR,欲扩增一条长四千bp片段,模板来自小鼠胚胎干细胞基因组DNA,一对引物分别为:正向5'-CGG AAA TGG ATG GAA GTT TGt gct gca gct-3'
反向5'-cga ata ttg gGA CTG CTC ACG GTA CCA ATA-3'
其中大写的是有效引物,小写部分为酶切位点及保护碱基.
基本的反应条件为:
94度 4分
94度 30秒
55.3度 45秒
72度 10分
30次循环
72度 15分
反应体系为:
10XLA Taq Buf(内含Mg2+,量未知) 5微升
dNTP(10mM) 1微升
一对引物(各0.11微克/微升) 各2微升
模板 3微升(其中DNA含量不详)
LA TAQ酶 0.5微升(含1.25个单位)
重蒸水 36.5微升
总体为50微升
第一次做完电泳结果中有很弱的目的带出现,且杂带很多.但后来再重复时及不稳定,有两次可以看到很弱目的带,有时却看不到任何带,只有一团发亮的荧光.
屡次改变条件,复性温度曾经换成54.2,56,57,模板量曾换成5微升反应体系中也曾加过DMSO,但除54.2度曾经出现过很弱的带外,56,57度下均无任何带出现.
此扩增的产物要用于做连接反应,因此浓度不能过低.
不知道问题在于什么地方,内行的还请指教,多谢,很急!(个人觉得问题可能在于模板)