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标题:[分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总

lixi559[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家反转录试剂盒用的哪个公司的呀 急需
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家有做miRNA 转染的吗 是怎么做的 用的什么载体 具体方法是什么
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蚊子[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问提血浆microRNA和PBMC microRNA在逆转录之前有没有区别，如果有，是什么？其实我还是没看明白stem-loop法和poly（A）法的区别，求教！谢谢。
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爱哭鬼[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是提取组织的miRNA做real timePCR，现在用trizol提取了总rna，打算采用加尾法反转录，看首页上说加尾法尽量要提取小RNA，还有，不知道Ologod(T)特异引物和Oligod(T)特异引物是打错了呢还是本来就是两种东西。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在也在做miRNA的RT-PCR，用的是polyA 加尾，Taq酶探针，扩增条件是：95摄氏度5min ,95度15sec,60度1min, 但是扩增不出来条带，是引物的问题还是应该将扩增步骤改为三步法呢？
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园丁##[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在也在做miRNA的RT-PCR，用的是polyA 加尾，Taq酶探针，扩增条件是：95摄氏度5min ,95度15sec,60度1min, 但是扩增不出来条带，是引物的问题还是应该将扩增步骤改为三步法呢？
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发表于 2011-10-7 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主好~ 请教个问题。我也是做了miRNA芯片，挑了几个差异显著的来做验证。taqman探针和相关RT及PCR的试剂盒都是ABI的。开始是用Trizol提RNA的。预实验结果内参在22个cycle左右，第一个miRNA在18左右，但是其他几个miRNA通通在35个cycle。 跟公司沟通过，认为Trizol提取RNA时miRNA损失较多。换了QIAGEN的RNeasy kit来提RNA。再次实验结果，内参和第一个miRNA没太大变化。有一个miRNA提前到32cycle左右。其他的还在35。

实验室的师兄师姐认为cycle在35，结果的可靠性较差。希望能再把cycle提前一点，不知还有没有什么好方法。

请各位不吝赐教。最近因为这个十分挠头~~~
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windy+++[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
LZ，你在RNA提取中提到的。血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。

要如何前期处理？
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发表于 2011-10-7 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近在做血浆miRNA检测。目前想先设计合成茎环结构引物，用sybgreen方法检验一下引物的好坏。到正式实验时，再订制探针做。存在的疑问就是：国内有几家公司，比如上海闪晶和上海基康，都可以合成MGB探针，考虑到价格和时间问题，ABI的货期太长，而且很贵，我想选择国内的探针做做。

不知道大家伙有没有人试过国内的MGB探针，效果好坏与否都来说说啊。。。谢谢！
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不懂[使用道具]
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发表于 2011-10-7 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
经过我个人的经验来看，推荐做miRNA的童鞋都采用茎环引物来反转，跟试剂盒比起来贵不了多少点点钱滴，至少不会被某些不良商家用特异性下游引物要挟啊
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