PCR仪

PCR新手，也要做miRNA的实验，请楼主或其他的高人指导一下：
①为什么用stem-loop的方法反转录，需要测定一个miRNA就反转录一次？不能一次把要测的几个miRNA的stem-loop引物都加进去？
②为什么用poly(A)的方法要比用stem-loop节省RNA？
②用poly(A)的方法反转录，之后qPCR时，一次能检测几个miRNA？
问题比较傻，刚开始学。谢谢大家了！

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1、如果你想一次反转录就得到所要的RNA，你可以吧几个loop引物放在一起，只是我没试验过，不知道分开好还是放一起好。
2、poly(A)的方法不比用stem-loop节省RNA，相反他需要更多的RNA。
3、如果用OligodT的反转录引物，你能检测你想要的miRNA，但是在反转录过程中，Oligodt的特异性要差一些。

再请教lz个问题，你用过+a尾，用t引物反转录的方法么。现在我用的特异性rt引物，每测一个mirna就得反转录一次，又麻烦又费钱。不知道+a尾的方法与特异性反转的方法相比特异性怎么样。lz有没有介绍这种方法的文献资料之类的？？

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OligodT方法反转录我尝试过，但是由于在反转录前需要PolyA加尾，RNA需要的量比较多，后来就放弃了（我从血液里提取RNA，得量不高）。关于灵敏度我可以告诉你同样的量的RNA用Loop反转录引物会灵敏度大得多。特异性来说，OligodT的反转录引物比特异引物特异性要低一些，但是PolyA的OligodT方法一样能得到特异的PCR产物。相对来说增加PolyA一步骤的成本同反转录相比应该差不多（没仔细算过）
你可以尝试下两种方法：1、把多个你想检测的特异引物放在一起进行反转录（引物之间有没有干扰等影响我没尝试过）；2、用OligdT引物进行反转录（如果你有比较多的RNA，）。

请教lz一个问题：用stem-loop的方法反转录microRNA后，qPCR可以用SYBR Green染料法吗？看文献上都是用探针法，我用了燃料法没有做出来，不知道这样做可不可行？新手上路，请多多指教！

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其实用什么方法都可以的。我一般是先用染料法验证RT引物和PCR引物怎样，然后再设计探针的。
如果你用染料发做不出来，原因你应该找一找，我想这跟用探针或者染料没什么关系。PCR产物跑过琼脂糖凝胶电泳没？？目的条带怎样？我想您可以这样试下：1、先用普通PCR跑电泳看看有没有条带，条带好不好？不好就需要找原因、优化 2、条带好的话，然后用染料法做，这样保证PCR体系本身没什么问题 3、如果你觉得探针法特异性更好（事实确实如此），在以上条件的情况下可以设计探针了

lz，你好，我想请教你：颈环法的那个颈环序列是什么？是通用的吗？O(∩_∩)O谢谢

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您好，您可以找找楼上我提供的两篇文章，分别是关于以上两种RT引物的序列的。也许可以给您一些建议和帮助。