PCR仪

想和你讨论几个问题
1.你在前面的帖子说，加A法比茎环的方法耗费的RNA量更多？但在反转录体系中加入的RNA量增大是可以提高检测灵敏度的，也就是说虽然加入了更多量的RNA，但实验的灵敏度得到了提高，所以不能直接说加A法比茎环法消耗的RNA量更多的。
2.对于茎环法的特异性，因为现在准备开展这方面的实验，也在这两种方法中犹豫。LZ现在的实验数据能够证明茎环法反转录的特异性比加尾法的高吗？虽然按照原理来说，在反转录阶段茎环法有反转的特异性而加A法没有，但我听说茎环法由于引物存在茎环结

如果大家的样本两位比较少又很宝贵（例如血清），我建议用比较好的RNA提取试剂盒来进行RNA的提取（QIAGEN公司的还不错，非广告），这样避免因为RNA没提好而浪费样本的情况发生。
另外因为样本量比较少，RNA用琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的完整性可能就行不通了，在这里建议的是或者直接测个OD就算了（电泳就是跑了也看不清条带），或者有条件的可以用一种微量测RNA OD的仪器，它可以给出RNA的峰图，效果还不错哦（可惜lz龄大健忘，忘记国外哪个公司的产品了。）
对于荧光定量PCR试验的一个重要问题就是：内参基因一定要选好，如果没有合适的，干脆去公司买一份U6的内参基因，这样既能保证您的内参基因完美、又能同时验证您的试验到底怎么样。

==========================================================================================

测OD也不准吧？血清中量很少的，OD值很低，仪器的偏差会影响到测定值的。微量的仪器是Thremo的Nanodrop吧。
如果买内参的话，是需要从提取时就要加入到血清中的吧，没有这样做过，呵呵！

如果SYBR染料实时PCR检测疾病组和对照组miRNA的差异，U6做对照，怎么摸条件啊。进行实时PCR前我用普通逆转录PCR跑胶，U6的亮度不一样。是不是每个样品中U6的量要统一？即：将U6的模板量统一。新手，请各位赐教！

==============================================================================================

U6做为对照的话，不需要调整的吧？只要保证U6基因的表达量不变就可以了。最后用U6的表达量做为均一化的标准即可。