PCR仪

如果SYBR染料实时PCR检测疾病组和对照组miRNA的差异，U6做对照，怎么摸条件啊。进行实时PCR前我用普通逆转录PCR跑胶，U6的亮度不一样。是不是每个样品中U6的量要统一？即：将U6的模板量统一。新手，请各位赐教！

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不用要求U6的量要一致阿，因为每个样本的目的基因是跟内参相比较的一个相对量（△△CT或便标准曲线）来进行比较。但是样本之间的U6的量比较能说明样本初始模板的量多少问题，具体比较的数据还是遵循以上的比较比较好。

测OD也不准吧？血清中量很少的，OD值很低，仪器的偏差会影响到测定值的。微量的仪器是Thremo的Nanodrop吧。
如果买内参的话，是需要从提取时就要加入到血清中的吧，没有这样做过，呵呵！

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Thremo的应该还是蛮准的。另外，U6 内参基因是用在PCR中的，我不知道楼上你说提取时就加进去作用是什么？
U6的内参基因是在荧光定量PCR中作为一个对照来对待的，每个基因的CT和内参的CT比较后用（△△CT）来得出相对比较值是相对定量的一种比较常规的计算方法，不知道你是不是有打算用此法还是直接做标准曲线来绝对定量。

其实用什么方法都可以的。我一般是先用染料法验证RT引物和PCR引物怎样，然后再设计探针的。
如果你用染料发做不出来，原因你应该找一找，我想这跟用探针或者染料没什么关系。PCR产物跑过琼脂糖凝胶电泳没？？目的条带怎样？我想您可以这样试下：1、先用普通PCR跑电泳看看有没有条带，条带好不好？不好就需要找原因、优化 2、条带好的话，然后用染料法做，这样保证PCR体系本身没什么问题 3、如果你觉得探针法特异性更好（事实确实如此），在以上条件的情况下可以设计探针了

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非常谢谢lz的建议！
你所说的“普通PCR”是指什么？非microRNA，某基因的mRNA翻转录产物PCR？microRN***段小，其PCR产物在琼脂糖凝胶上可以看到条带吗？

我看过很多帖子和文献，设计了一个STEM-LOOP引物，希望大家给个意见。
GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGAC TCAACA

GTCGTATCCAGTGC和CGCACTGGATACGAC是互补成茎的，AGGGTCCGAGGTATT就是环，TCAACA是我做的miRNA的3端互补。

虽然设计出来了，但是就是不知道回来如何处理成环，希望大家能给点意见。看文献没有找到，之前咨询过说通过60,95退火，但是不知道时间是多少

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楼上是直接合成还是以上序列分开合成的?如果是这些序列连在一起合成的,你就不用担心环状问题,拿来稀释成5uM的直接用就可以哦.不用担心它成不成环状问题.例如就是按照Invitrogen的Supper Script 2的说明书，首先RT引物和RNA在65度变性下（大概可以成环了），其他按照说明书操作就好。

楼主 首先感谢你分享这么多有用的东西
目前我遇到这样一个情况
realtime PCR过程中
我的U6效果一直很差 荧光值上不去
如果您愿意又方便 能否请您上传一套您使用效果很好的U6 RT (STEMLOOPPRIMER) 以及forward and reverse primer
非常感谢

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你好，我的U6是用的ABI的产品，由于自己设计的一直没有办法跟AB的产品有能力比较，加上经费紧张，就放弃了。我原来的考虑U6 CT值靠后的原因是RT引物后面的U6基因的锚定碱基太少了（我用的最多是8个碱基），也许再多几个应该就可以了（12－14个）因为你也知道，U6的序列比较长大约200bp左右，所以多加几个锚定碱基应该对序列本身没有多大影响。

分享一下我的实验经历，同时希望各位给点建议哦。
我做血清microRNA表达分析，目前用的内参为U6.用100ul血浆提取的总RNA(Ambion 1556试剂盒），荧光定量试剂盒为ABI公司的探针法。RT 为15ul,PCR体系为5ul(384孔板）。结果是样本中U6的CT值都很高，平均32以上，不知能用吗？ 想提高点有什么办法吗？
另外，我还测了总RNA的OD,浓度大的有20ng/ul,小的也有4ng/ul.

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如果全部用AB的产品，U6还那么靠后的话应该是血浆中RNA实在是很少。那么请问您反转录的时候RNA加多少？？我的建议是：把反转录体系里的水都换成RNA，这样也许会得到较多量的cDNA.
如果U6的内参引物（RT和PCR）探针是您自己设计，那么需要您用全血或者组织里提取的RNA反转录的cDNA做模板进行比较下，看看是不是由于U6本身的RT引物、PCR引物等的原因