PCR仪

如果全部用AB的产品，U6还那么靠后的话应该是血浆中RNA实在是很少。那么请问您反转录的时候RNA加多少？？我的建议是：把反转录体系里的水都换成RNA，这样也许会得到较多量的cDNA.
如果U6的内参引物（RT和PCR）探针是您自己设计，那么需要您用全血或者组织里提取的RNA反转录的cDNA做模板进行比较下，看看是不是由于U6本身的RT引物、PCR引物等的原因

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恩，一方面我想提高血浆量，二是按你说的，反转录多加总RNA.
U6的引物探针都是ABI的。

请楼主回答我的问题 1.我是新手，全血miRNA前期怎么处理后？然后才能用trizl和氯仿
2.全血miRNA好提取吗？我担心啊提不出来。

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您好，全血提取miRNA我是用的QIagen的全血RNA提取试剂盒加上他的EL Buffer，前期处理是拿1ml的全血（少了没试过）用ELBuffer进行溶解红细胞，离心后在进行Trizol的提取（试剂盒的Qiazol其实是一样的），这样提取出来的RNA ，取5ul进行特异RT引物的反转录后进行PCR的CT值在13到16之间。

另外，QIAGEN的ELbuffer我不知道配方，所以暂时我建议你可以单独购买QIAGEN的EL Buffer，处理后，然后用Tizol常规提取。

非常谢谢lz的建议！
你所说的“普通PCR”是指什么？非microRNA，某基因的mRNA翻转录产物PCR？microRN***段小，其PCR产物在琼脂糖凝胶上可以看到条带吗？

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我的PCR产物40到110的条带不等，但是用3％的琼脂糖凝胶跑电泳时间长一点还是能看出来的，（二聚体全都弥散掉了）

不知楼主对miRNA内参了解多少
能不能给详细介绍一下，尤其是u6和u6B，至今还迷糊着呢~

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miRNA的内参我觉得个人喜好，拿U6来说,miRNA的数据库和AB（AB的有600多bp的，到那时前面120bp左右与它们的序列一样）的数据库都是两条（应该是U6B和U6），序列同NCBI上的U6一样。这两条基因一个50bp左右，一个120bp左右，我是用的120bp左右的序列设计的引物（这个内参比较郁闷，建议在设计RT引物的时候U6的锚定碱基加长到12bp左右），染料法CT值13，探针法CT值14－15（AB的U6引物探针用相同的模板CT值14－15）.
另外有个内参5sRNA，我从老鼠那里得来的，具验证人的一样用，这个内参比较容易出来，锚定碱基6个就够了。

您好，全血提取miRNA我是用的QIagen的全血RNA提取试剂盒加上他的EL Buffer，前期处理是拿1ml的全血（少了没试过）用ELBuffer进行溶解红细胞，离心后在进行Trizol的提取（试剂盒的Qiazol其实是一样的），这样提取出来的RNA ，取5ul进行特异RT引物的反转录后进行PCR的CT值在13到16之间。

另外，QIAGEN的ELbuffer我不知道配方，所以暂时我建议你可以单独购买QIAGEN的EL Buffer，处理后，然后用Tizol常规提取。

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尊敬的楼主先生，我主要想知道：1，因为组织标本，我们可以保存在液氮中，全血标本前期的处理在网上我找不到，我最关心的是处理后怎么保存，能保存多长时间，因为我们的实验室离得有点远。2，还有，我想知道怎么去测量一个miRNA cDNA和内参基因PCR时的扩增率，3，由于我刚刚学习实验，最后那个CT值测出来的是（CT目标-CT内参）还是分别可以测出来（这问题可能有点傻里傻气的）4，我想问一下楼主是否了解REST软件 希望楼主能尽可能的回答我的问题，我会经常光顾楼主的帖子的！谢谢！

尊敬的楼主先生，我主要想知道：1，因为组织标本，我们可以保存在液氮中，全血标本前期的处理在网上我找不到，我最关心的是处理后怎么保存，能保存多长时间，因为我们的实验室离得有点远。2，还有，我想知道怎么去测量一个miRNA cDNA和内参基因PCR时的扩增率，3，由于我刚刚学习实验，最后那个CT值测出来的是（CT目标-CT内参）还是分别可以测出来（这问题可能有点傻里傻气的）4，我想问一下楼主是否了解REST软件 希望楼主能尽可能的回答我的问题，我会经常光顾楼主的帖子的！谢谢！

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呵呵虾客气。
我也是做了没多久，大家讨论下好了：1：（待抗凝剂的）血液可以放在液氮（要封闭好哦）或者干冰运输，这样可以保存比较长的时间（我的先用干冰后放在－80度冰箱，保存半年还能用）。2：一个引物和探针的扩增效率可以用稀释的模板来做类似标准曲线的方式计算得出，有相关的计算公式您不妨查一下；3、每个基因的CT值就是这个基因的CT值，如果您想要
△CT需要您计算得出（CT目标-CT内参）;4、最后很遗憾，看样子我要多学习下才行，我去网站搜搜，看看是什么样的软件，如果您熟悉，可以帮我等扫扫盲。希望能解答您的问题。嘿嘿

ps：REST软件是不是网络的那个，还真不知道呢，没用过，不知道怎么用，咱只用过HTTP。

1，你那个血液用的是SYBR Green Ⅰ染料荧光分析的茎环Realtime RT-PCR还是Taqman探针，我用前者，不知道能不能做出来
2，我真的找不到扩增率的计算公式，如果有什么软件可以计算的话就更好了，楼主那如果有的话我一个公式，跪谢！

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你好，因为节省成本，我是先用Srby Green做CT曲线，然后跑电泳，如果效果都很好，才开始合成探针，相对来说CT值相差不多。但是用染料法需要把引物的浓度降到最低（梯度稀释）以避免引物二聚体带来的荧光干扰；
2、引物的扩增效率公式：扩增效率E%=[10^1/|K|-1]*100%，其中K为标准曲线斜率