[分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总 - 经验共享

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标题:[分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

推荐miRNA检测的一种Taqman 水解探针法。
作者采用了罗氏的探针，特异性比不上ABI的，但是成本和sybgreen的价格差不多，效果要比sybgreen好很多。

目前市场上面 ABI的Taqman miRNA 是miRNA 检测的金标准。

另外常用的还有基于 stem-loop的（stem loop 是ABI的专利，所以正规的大公司都不会有Stem loop的试剂盒）
1. Sybgreen方法（客户群最多，但是效果不稳定）
2. 自行设计的Taqman方法（由于合成的探针是国内的普通探针大概20多个bp比ABI的MGB探针至少要多出6个bp，再加上引物常常会把miRNA挤的很满）

基于加尾方法的
1. Qiagen公司的试剂
2. Exiqon公司的试剂采用了锁核酸技术同时有人的全miRNA基因表达芯片产品

饭团团[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主啊楼主我请教你我什么我的PCR结果曲线高度不够，而且电泳没跑出来是怎么回事啊，大哥请指教

avi317[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主啊楼主我请教你我的PCR结果曲线高度不够，而且电泳没跑出来是怎么回事啊，大哥请指教

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关于您的问题，其实曲线高度不够只是荧光信号问题，跟PCR产物有和无关系应该不大，因为没有图，不能看看您的曲线是什么样子。还有不知道您的实验又没有NTC？有的话NTC有没有曲线？还有就是电泳的二聚体亮不亮？多大的胶？
实验如果不出东西就一项一项排除，最后您的就一定能得到结果（我的方法，可能比较笨点，我觉得还十分管用）

applebook=213[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我想利用外周血直接做PCR，您在帖子里提到的血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。能具体说说吗，或者我应该上哪里找相关资料呢？谢谢

avi317[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我想利用外周血直接做PCR，您在帖子里提到的血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。能具体说说吗，或者我应该上哪里找相关资料呢？谢谢

==============================================================================================================

你好，全血的话需要去除红细胞，一般使用5-7倍体积的Qiagen的EL Buffer（其成分本人没有研究过，并不了解，我想用RNAse Free的水也许可以）稀释全血，一般冰上放置10min的样子，具体的您可以在网上找下Qiagen的RNA提取KIT的说明书；

至于植物您也知道植物需要去除过多的多糖、等等物质，所以需要前处理（所用溶液许多公司有卖tiangen、TAKARA都有）。

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发表于 2011-10-6 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好，我做4种组织中的microRNA，PCR曲线出来了，不知道正不正确，让你参考一下，电泳没出来（别人说是引物二聚体），不知道什么原因，我给你看一下总的情况，麻烦楼主看一下我整体的情况，给予指正：
1，茎环引物设计，我是按以下条件设计的，楼主看看有没有问题：microRNA的引物设计
以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，
固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，
TGGTGTCGTGGAGTCG
在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为
5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，
正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG
在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：
5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3，
URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT

眼药水~[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2.RT的反应体系及其反应条件：
反应体系(25ul)：总RNA逆转录 2ul
茎环RT引物 2ul
RNase inhibitor 1ul
MLV-逆转录酶 1ul
dNTP 1ul
buffer 5UL
水 13ul
反应条件为：25度 10min,42度 60min,52度15min，70度15min,反应结束后-20度保存（我一般是-80度保存）

眼药水~[使用道具]
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发表于 2011-10-6 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3.SYBR green 反应体系及其反应条件：
反应体系（25ul有两种）：
5乘R-PCR Buffer 5ul(5ul)
无Mg2+(因为Buffer里有) 0
10mM dNTP 0.75ul(1ul)
10uM 上游引物 0.5ul (1ul)
10uM 下游引物 0.5UL (1ul)
25乘SYBR green 1.0ul (1ul)
ROX 1ul (1ul)
DNA聚合酶 0.25ul（0.5ul）
dd水 14.7ul(12.5ul)
模板（CDNA） 1.0u
反应条件：95度变性10min 95度15sec ,60度 1min (40个循环)

眼药水~[使用道具]
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小中大

4。PCR的结果1（附图）