PCR仪

楼主您好，我也是刚开始做RT-PCR，有几个问题想向您请教一下
1。我想分离血液中的单个核细胞，再从单个核细胞中提取总的RNA检测microRNA，请问是不是可以用Trizol提取总的RNA，还是一定要买特异性的microRNA专提试剂盒
2.在我查阅的外文文献中基本上绝大多数都是用ABI公司的Taqman探针法或者茎环法做的，基本上没有使用染料法检测microRNA，是不是因为探针法特异性高，能特异性的检测成熟的microRNA，避免了前体的干扰，因此SCI的文章不接受染料法做的microRNA的结果
，必须使用探针法或者茎环法这种特异性高的检测方法才可
3.使用探针法检测，是不是常规预先需要使用染料法摸索反应条件？
4。探针法所需要的引物和特异性探针是不是均可以向ABI公司购买？检测一条成熟的microRNA所需试剂（以ABI公司产品为例），大概需要多少费用
非常感谢楼主能百忙之中能解答，谢谢了

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1、既然颈环状的RT引物，就不需要刻意提取MiRNA了（单细胞本来RNA就不多），由于单纯Trizol分层提取的RNA中MiRNA的的量比较少，既然楼上的经费比较充足，还是在Trizol处理后过下柱吧（可以收集miRNA的KIT的柱子）。
2、颈环RT引物和探针的PCR方法特异性确实比染料法高（您也知道MiRNA的PCR片段太短，用染料法会有二聚体干扰），当然，在前期为了节省成本，先用染料法优化好RT引物、PCR引物后再设计探针会比较好一点（周期可能较长）。至于发外文用什么或者有什么规定我也不清楚，我个人以为你说得有道理。
3、当然不一定必须使用染料法摸索。如果RT引物和探针买的话，直接用就可以了。价钱每个地方可能不一样吧，你最好问下AB的代理或者销售，也许他们有啥优惠活动呢（YY下）。
4、我是买了AB 的内参的RT引物和PCR引物探针的一套，然后参考文献说明自己设计RT引物、PCR引物和探针，用AB的做参照。毕竟我的经费不多。
希望对您有所帮助。

lz你好！新手 多多指点 我想从血浆中提取microRNA 实验还在设计中 有几个地方不是很明白
1.血浆中的microRNA含量很少，前期是怎么处理的啊？？你感觉用多少ML的血提取比较合适？我看了有篇文献报道说外周血标本离心以后-80℃保存？能保存多长时间啊？但是他先把血液离心后 可以保存到-80℃，做的时候用的是试剂盒（mirvana PARIS Ambiton） 由于经费问题 不能考虑用试剂盒。按照常规方法提取总RNA吗？这样做可以吗？？
2.把论坛的帖子看了又看，才稍明白：要想发好点的文章的话，基本上就要用 LOOP 引物（ABI专有的）
3.检测要用探针法 不能考虑染料法？？
谢谢

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请问是全血还是血浆啊？？RNA含量差别老大的。如果血浆的话，建议越多越好咯（本人没做过血浆的，感觉有些难度，说的不对表喷我），由于MiRNA很短，一般RNA降解了它也不会降解，所以不用担心（如果总RNA还有他用则另当别论）。就像上面说的一样，一般Trizol分层方法的MiRNA得量不是很高，你可以用普通方法试验下，看看内参CT有多少，如果太靠后的话，你需要改进试验方法了。
其实颈环状引物也可以用染料法的（当然染料法由于方法本身有所局限）。但是就楼上的战友考虑的：会不会对发外文有影响不得而知。
楼主一家之言。各位战友不要客气啊，随便喷啊

请问是全血还是血浆啊？？RNA含量差别老大的。如果血浆的话，建议越多越好咯（本人没做过血浆的，感觉有些难度，说的不对表喷我），由于MiRNA很短，一般RNA降解了它也不会降解，所以不用担心（如果总RNA还有他用则另当别论）。就像上面说的一样，一般Trizol分层方法的MiRNA得量不是很高，你可以用普通方法试验下，看看内参CT有多少，如果太靠后的话，你需要改进试验方法了。
其实颈环状引物也可以用染料法的（当然染料法由于方法本身有所局限）。但是就楼上的战友考虑的：会不会对发外文有影响不得而知。
楼主一家之言。各位战友不要客气啊，随便喷啊

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全血里面血细胞里面应该含有很多microRNA吧 我做的是血浆 里面相对来说少一些 我们实验室设计的引物都是商品化的microRNA全套引物 用的也是染色法 提血浆里的总RNA（然后rt-pcr区分）吧，应该是这个意思吧 他的具体流程是什么啊？？

关于3'引物，我最近用了一个叫Bioo Scientific的公司的盒子，他们用的是另一种技术，直接在miRNA3'端连接接头然后通过接头对应引物序列完成全部miRNA的反转录，我用total RNA和富集的miRNA都试了下，效果不错。非广告。LZ对这种方法也许可以补充下。

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不知道这种方法与上两种方法比较怎么样？兄弟可以把这个产品的实验方法发下或者把该公司的说明书影印一份，供大家参考。或者您以上方法都用过，希望给个参考信息。

我的本意是提供一个集中的关于MiRNA的平台，大家可以在这里互通有无。所以希望广大有经验的战友多多提供意见以及帮助，而不是光有我在这里班门弄斧。