小中大正向引物:序列5,-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3,
URP:统一反向引物,也是一段固定的序列,TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ,R-AACGCTTCACGAATTTGCGT
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你好,由于您的图片看不到,只能就您的引物来分析下:就您的正向引物来讲,这个引物的TM值高达76度,而反向引物TM值只有51度。从这里分析:这对引物由于TM相差实在太多,(Primer Express3的参数)我以前做的是在正向引物的5‘端加几个类似保护碱基就够了,没有像您那样加的那么多,而且在引物设计时,最好能引物设计和本身序列两方面都考虑下,找个折中的引物序列。而且检测基因的引物跟您的U6引物的TM值最好相近(毕竟您要他们在一个PCR仪里面同时工作)。
PCR产物没有的话应该没扩增。如果您的实验有CT值的话,请问做没做NTC?NTC有没有CT值?
希望对你有用。