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标题:[精华]酶切问题讨论专栏

@花开花落@[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位大侠，我想问一下，是否所有的pcr引物都需要保护碱基，引物没有保护碱基能行吗？

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in case that u make T/A cloning, blunt end cloning, u dont need 保护碱基
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跳跳糖[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教: 我的1500bp的目的片断经质粒抽提后进行Bamh1和Nde1双酶切，两个小时后检测，目的片断消失，只看到200bp左右的弥散片断，请问出现这样的现象时否因为酶切时间过长，TAKARA公司和MBI的酶我都用过，都是这样的结果。但是转化DH5α菌后再抽提质粒进行酶切，就能切出目的条带，而且是有时能切出条带，有时候检测什么都没有了，请问这是什么原因？非常感谢
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知了知了[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位请问一下灭活内切酶的温度要求是多少?
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问个问题：我做酶切连接老是不成功．
　我的PCR产物是用胶回收的,回收完,估量后,酶切,20微升体系,400ng的DNA,0.5微升的NCO I ,切2.5小时! 酶失活后,用乙醇沉淀后,再用０.５微生Sal I 切2.5小时,也是20微升体系! 最后胶回收酶切PCR产物与同样的方法酶切载体一起电泳,估量,16度14小时连接.转化只有１０个左右，
　不知各位高手能不能给点建议，帮我改进一下，让转化率高一些！
　　谢谢！
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tears[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教高手，我的PCR产物酶切过夜后用琼脂检测就什么都看不到了，酶切3个小时还能检测到产物，4个小时就什么都检测不到了更别提过夜了，请问这是为什么啊？是酶的活性问题还是PCR产物的问题啊？  
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wawa[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问各位高手：用Hpa I和Nco I（均为大连宝生物的）进行双酶切时，可否同时切，它们没有共BUFFER,但Hpa I的BUFFER是K,Nco I的BUFFER是K加BSA，而且反应温度都是37。还有如果是不能，需要一个一个切的话，应先切那个呢？切完应如何进行乙醇沉淀纯化呢？具体是怎么操作呢？谢谢指点！
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森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
BUFFERK加BSA切
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锤子[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是标准的新手 大家一定要多指点啊 呵 我好不容易要了一个带目的基因的质粒 可是没有构建图 请问怎么办啊 设计引物PCR拉出来吗？ 目的基因差不多2KB ，还是用最外边的酶切？都有什么好办法啊 我现在不知从哪下手阿 各位大侠帮忙啦
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