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标题:[精华]酶切问题讨论专栏

fangxiang[使用道具]
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11
 
是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基?
我的酶切位点都在PCR产物内部包含,还需要在引物上加保护碱基么?  
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3N4G[使用道具]
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12
 
不需要的,连接到T载体上直接就可以酶切鉴定!
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丸子妹[使用道具]
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13
 
我的PCR产物的酶切位点XbaI的保护性碱基是CG,HbaI也是CG,会影响我的酶切吗,我十分担心,高手能指点一下吗
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二丫头466[使用道具]
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我的质粒是pcdna3.1+cfp-c1 , 6000多bp!有一个not1的酶切位点,我酶切了很多次都没有成功?酶切都是2条带。我用50ul体系,加了15ul的质粒(100ng/ul),2ul的酶,发应了10个小时还没有切动。请高手指点,谢谢了!
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=菓子=[使用道具]
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我现在双酶切一个T载体连接产物,用的是和EcoRI,先用BamHI30度切5小时,之后沉淀线性DNA,方法是:加入1/10体积的乙酸钠和风细雨2.5体积的无水乙醇,18000转15分钟离心,再加入70%乙醇15000转离心10分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入EcoRI的酶切体系37度切5小时.可是结果总是不对.本应该是2000和3000两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊?请大家 帮帮忙!
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=菓子=[使用道具]
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16
 
另外我还要双酶切pcDNA3.1,但是因为也是用的BamHI和EcoRI,所以切下来与没切开的片段相差只有几十bp,电泳根本看不出来,那我如何才能判断出来到底有没有切下来呢?难道只能等连接上了才知道吗?
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3N4G[使用道具]
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17
 
1)你首先要确定片段是否已经连接到T载体上;EcoR I和BamH I有共有的buffer,就用BamH I的自带buffer试一下。
2)确定BamH I和EcoR I的酶切效率,你可以找一个其它的单酶切位点,和BamH I或EcoR I双酶切,注意切下来的片段最好能达到400bp左右,酶切总体积可以加大些!
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森林木[使用道具]
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18
 
我其实这三个月一直在这上面打转,酶切,连接,转化。我把我的问题与经验提供出来,一则借鉴,再则希望那位高手指点一下。我是把目的基因与T-VECTOR连接后再进行酶切,这样做酶切效果好,而且也方便,你还可以不用加保护碱基,有时连酶切位点也不用加,直接用T-VECTOR上的。每切的好坏与你提的质粒有关,如切不动,可以在提的时候多洗几次。切碎则与盐有关。时间一般在4小时之内,时间过长会出现乱切,下一步连不上。一般情况下,4小时切不动,再长也不行。我的烦恼是,我的双切载体与目的基因都很好,单带,很清晰。转化过程也反复验证没有问题,但就是得不到阳性转化子,问题集中在切胶回收,连接这几步。请高手指点迷津,切磋一下。
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3N4G[使用道具]
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得不到阳性转化子,我想应该分析:
1)胶回收。为了获得较多的酶切产物,应该扩大酶切体积,回收最好取几3ul电泳,以检测回收效率如何,也可以用分光光度计测定回收产物浓度,洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2)连接问题。连接我一般10-15ul的反应体积,载体和PCR产物摩尔比一般为1:1-1:3,T4 dna ligase很重要,连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。连接最好16度水浴连接过夜。
3)感受态的问题。转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高,如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4)抗性平板问题。AMP的浓度50-100ug/ml都行,最好用新制备的平板,LB的高压时间不要太久,15min足够,以免破坏培养基的营养。
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3N4G[使用道具]
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新英格兰公司提供的:双酶切buffer的选择
注:
U
Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart.

BSA
Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 µg/ml.

SAM
Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card.

dd
When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity.

*
Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart

NR
This buffer is not recommended for use with with this enzyme

Buffer Compositions
(1X): NEBuffer 1 (yellow): 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 at 25°C). NEBuffer 2 (blue): 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C). NEBuffer 3 (red): 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C). NEBuffer 4 (green): 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C).

DetaiLed information :cuturl('http://circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_legend.html')


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2011-10-7 16:16
24515305_snap.jpg (48 KB)
 
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