PCR仪

得不到阳性转化子，我想应该分析：
1）胶回收。为了获得较多的酶切产物，应该扩大酶切体积，回收最好取几3ul电泳，以检测回收效率如何，也可以用分光光度计测定回收产物浓度，洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2）连接问题。连接我一般10-15ul的反应体积，载体和PCR产物摩尔比一般为1：1-1：3，T4 dna ligase很重要，连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。连接最好16度水浴连接过夜。
3）感受态的问题。转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高，如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4）抗性平板问题。AMP的浓度50-100ug/ml都行，最好用新制备的平板，LB的高压时间不要太久，15min足够，以免破坏培养基的营养。

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谢谢你的建议，是的我也考虑了这几点。（1）胶回收，由于酶切是上1下5，在回收时是否会断裂，加热60-70度是否影响。（2）连接，第一，在分子克隆上提到，若连接困难，可能末段封闭，因此建议连接之前45度保温5分钟。这一步是否必要。第二，体系（10ul），我一般是凭感觉，若回收的载体中度量（5微生）目的片段微弱，比例如何好。第三，连接酶。我不知到有多长时间了。对照我是否可以用单酶切看连接效果。（3）感说态是自己制的，用载体直接转过，没问题。（4）平板经常出问题，有时不长，有时长的不是转化子，问题在于到平板时不能太凉，结果抗生素没混匀。另外，还有一个情况，我前面在做T载体转化时，也是转不出来，是一个老师转的。情况与此差不多。综合这些情况，再请教以下？多劳驾了。

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是： ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了　两个碱基，ＧＡ。　我用的酶是生工的Ｔａｑ　ｐｌｕｓ，　最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ　是引物的‘５’端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消失。　恳请大虾指点迷津。

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是： ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了　两个碱基，ＧＡ。　我用的酶是生工的Ｔａｑ　ｐｌｕｓ，　最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ　是引物的‘５’端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消失。　恳请大虾指点迷津。　

我来了三次了，可是每次的问题都没有高手指点啊，主任能帮帮我吗？好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶，HpaI和XbaI，但我PCR产物的保护性碱基是CG，会影响酶切吗？电泳显示质粒酶切后跑慢了，连接后转化，试验组（和目的片断连接的质粒）和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。密度还差不多，是否说明我酶切不好？
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？还是一定要做T载体连接？

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1）MBI的内切酶还可以，XbaI用过，酶切效率不高，酶切过的质粒做的对照也有转化子，我想肯定没有切完全或酶切后没有胶回收。
2）用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序，并不是一定要做TA克隆，PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。

我来了三次了，可是每次的问题都没有高手指点啊，主任能帮帮我吗？好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶，HpaI和XbaI，但我PCR产物的保护性碱基是CG，会影响酶切吗？电泳显示质粒酶切后跑慢了，连接后转化，试验组（和目的片断连接的质粒）和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。密度还差不多，是否说明我酶切不好？
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？还是一定要做T载体连接？

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1）MBI的内切酶还可以，XbaI用过，酶切效率不高，酶切过的质粒做的对照也有转化子，我想肯定没有切完全或酶切后没有胶回收。
2）用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序，并不是一定要做TA克隆，PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是： ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了　两个碱基，ＧＡ。　我用的酶是生工的Ｔａｑ　ｐｌｕｓ，　最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ　是引物的‘５’端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消失。　恳请大虾指点迷津。　

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我想你的猜测有道理，Ｔａｑ　ｐｌｕｓ的保真效率高，适合长片段（10-30kb）扩增，公司的说明书上有这样的描述：
(1) high fidelity with an error frequency 1.6 / 106 (or 0.0016/103) during DNA synthesis.
(2) Taq Plus increases the efficiency of polymerization reaction, resulting in a great percentage of extenuation reaction complction up to 10 kb to 30 kb. Pfu has a temperature optimum between 72-78 ℃ and remains > 95% active following 1-hour incubation at 95 ℃.

５’端碱基可能与你的酶有关系，最好换其它的酶，如果你要扩增长片段的DNA，可以试一试Takara的Taq Ex。不过高保真与外切酶活性是一个矛盾。