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标题:[精华]酶切问题讨论专栏

3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1)如果PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上，可以在设计引物时不用考虑保护性碱基，比较PCR酶切，克隆到T载体效率较高，但我一般都设计保护碱基。
2）可以不严格遵守引物扩增的基本原则，但最好不要有错配，这还要看你的模板来源，之前可以做对比。引物的3端最好为A、G、C，避免是T，但避免3个连续的G或C出现，尤其在在3端。
3）用的高保真的TAQ酶不能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基腺苷，最好不用这种酶，如果是长片段产物，可以用其它的Taq 酶。
4）关于PCR产物克隆问题，我觉得可以两条途径进行，TA克隆是一条路，PCR酶切产物克隆是另一途径。
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大桃子同学[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢斑竹，可是我克隆的是一个启动子序列，然后拿到报告载体中进行表达，所以一般要求是高保真的酶进行扩增。PCR酶切产物克隆，是不是将产物直接连到目的载体上，还是通过一别的中间载体(如PUC载体）定向连接克隆后再连接到目的载体。（因为刚接触，所以有些问题也许很弱。）
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发表于 2011-10-7 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我没有做过启动子序列的克隆，但具体情况具体分析，选择酶切位点很重要，你应该根据你的载体及promotor序列进行综合考虑。
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海鸥crazy[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢啦!我把我的一个引物输入到一个引物设计软件中,说其不可用,说3'端自身互补,且过于稳定,请斑竹看看并予以指导.
下游引物5'AAG CTT AGG GCT TCC CAC GTG CGC AG 3'
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3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
形成发卡结构关系不大，后续优化PCR反应条件应该能扩出来，我设计的一对引物只有22个base，与目的基因互补的序列只有13个base，打分只有60分，P的产量很高，特异性也很高（质粒为模板）。如果你引物的其它一般原则都具备，先试一试，先合成2OD，合成引物也不是很贵嘛！
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海鸥crazy[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对了还是想请问一下,在合成引物时,你们通常用不用HPLC纯化.因为我要扩启动子区,GC含量高,所以较为困难.  
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发表于 2011-10-7 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有吧，引物都是PAGE纯化的，纯度可以达到99%！
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发表于 2011-10-7 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题，请大师们指点。
我用EcoI和XhoI进行双酶切鉴定重组质粒时，切了好几次都没切开，请问有什么原因影响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段，质粒酶切时我用了15微升，两种酶切用了2小时半，选的是两种酶的通用buffer。
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鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位帮帮我吧：我的PCR产物回收后，用EcoRI和XhoI双酶切，然后和EcoRI和XhoI双酶切的载体PET30a连接，转化BL-21(DE3)感受态细胞，想进行蛋白的表达，可是做了快一个月了，转化后，一个菌都不长，感受态细胞用空载体检测过，转化率挺高的。PCR用的两条引物，分别加了EcoRI，XhoI得酶切位点，并有三个保护碱基，PCR产物的大小为2.1Kb，因为酶切过只有少数几个碱基去掉，所以不知道PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀，那一步出问题我都找不到，PCR产物酶切时间是过夜
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森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题，请大师们指点。
我用EcoI和XhoI进行双酶切鉴定重组质粒时，切了好几次都没切开，请问有什么原因影响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段，质粒酶切时我用了15微升，两种酶切用了2小时半，选的是两种酶的通用。

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你的情况基本上与酶切buffer，体系，时间关系不大。如果能切开，2各小时足够了，只回存在酶切不完全。你考虑以下原因；1 根本没转入。菌落PCR假阳性非常多，2 载体提取的不，乙醇或蛋白抽提不净，你可再出提一次，用70%乙醇洗两次，待乙醇挥发干净。
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