PCR仪

各位帮帮我吧：我的PCR产物回收后，用EcoRI和XhoI双酶切，然后和EcoRI和XhoI双酶切的载体PET30a连接，转化BL-21(DE3)感受态细胞，想进行蛋白的表达，可是做了快一个月了，转化后，一个菌都不长，感受态细胞用空载体检测过，转化率挺高的。PCR用的两条引物，分别加了EcoRI，XhoI得酶切位点，并有三个保护碱基，PCR产物的大小为2.1Kb，因为酶切过只有少数几个碱基去掉，所以不知道PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀，那一步出问题我都找不到，PCR产物酶切时间是过夜

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见你的问题我就想掉泪，我已做了三个月。我们情况熟悉，互相交流一下，也许大有裨益。有几个建议，1你把PCR后的片段先与T载体相连，然后再做酶切，这样就可以解决你讲的问题。2 PET30a酶切也存在这个问题，你可做单切作对照，若也做不出来，那就只能是连接酶的原因了。3 酶切时间是过夜到不必，切长了反而不好，若你一直这样做，也许问题在这，时间应控制在4小时之内。希望你能把你的感受发出来，互相借鉴。

谢谢，我正要重新提取质粒。我做PCR不是用的菌落，是用接种针挑很少的菌落接种LB，培养后取1微升的菌液做为模板进行PCR鉴定的，不知这种情况下的假阳性有多高。以前我转化不成功时PCR基本都是阴性。

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菌落PCR是指直接用菌作摸板，所以你的做法也属于此。假阳性很高，我最初作这个实验，看到这便筛，结果一个也没有。你可以用以前的摸板作对照，扩出的片段亮度应相同，才可以初步确定。

菌落PCR是指直接用菌作摸板，所以你的做法也属于此。假阳性很高，我最初作这个实验，看到这便筛，结果一个也没有。你可以用以前的摸板作对照，扩出的片段亮度应相同，才可以初步确定。

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我用以前的模板做对照的，我用菌液和提取的质粒做PCR，扩出的片段亮度基本都比我用模板扩出的条带亮度高，有的高很多。