小中大2）连接，第一，在分子克隆上提到，若连接困难，可能末段封闭，因此建议连接之前45度保温5分钟。这一步是否必要。第二，体系（10ul），我一般是凭感觉，若回收的载体中度量（5微生）目的片段微弱，比例如何好。第三，连接酶。我不知到有多长时间了。对照我是否可以用单酶切看连接效果.4）平板经常出问题，有时不长，有时长的不是转化子，问题在于到平板时不能太凉，结果抗生素没混匀。另外，还有一个情况，我前面在做T载体转化时，也是转不出来，是一个老师转的。情况与此差不多。综合这些情况，再请教以下？多劳驾了。
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1。对于第二个问题我觉得没有必要，我一般都没做过这步。
2。pcr产物的量和质粒的量一定要大，如果量少我建议你不要往下做了。这往往是起决定作用的，量大分子发生碰撞的机会才多，才能连上。
3，连接酶很重要，我们实验室用neb的酶，效果很好。
4。平板一定要过关，本人同意版主的意见，最好是新倒的
