[精华]酶切问题讨论专栏 - 经验共享

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标题:[精华]酶切问题讨论专栏

3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得不很好，PCR反应液里的离子浓度与内切酶是不一样的，而且还有多聚酶的干扰等，建议纯化后再酶切！

dreaming[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

hi, all,

any comments on the usage of mung bean nuclease are most appreciated.

higher concnetration / longer duration is not so good?!
thanks.

圆圆圈圈[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小葵[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用salI和ＢamHI对一个重组子进行双酶切，可我拿到手的酶是不同的公司生产的，且各自buffer的组成相差极大，请问我可以用salI酶切以后，再用酚，氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用ＢamHI酶切吗？

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发表于 2011-10-7 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用salI和ＢamHI对一个重组子进行双酶切，可我拿到手的酶是不同的公司生产的，且各自buffer的组成相差极大，请问我可以用salI酶切以后，再用酚，氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用ＢamHI酶切吗？请高手指点

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先切了试试吧，我原来也是用这两个酶的，如果不行，选择比较适中的BUFFER

3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也来求教一下我的问题:
我是先用宝生物的NotI和NdeI双酶切PCR产物和pET21b质粒.PCR产物有9个保护碱基, 质粒上的酶切位点也离得足够开了.我的酶系统一般是100ul,两种酶各加10-15U. DNA量小于1ug. 切6个小时. 后来因为一直做不出阳性克隆,也试过单酶切两次. PCR产物先用NdeI 在80ul体系中切2个小时,再加到100ul用NotI切2个小时.质粒切得久一点,分别是4个小时.然后胶回收.用promega的ligase在15ul体系中,放了100ng质粒, 70ngPCR产物, 1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性对照, 没有问题.

我想问的是:
1)NotI对甲基化敏感, 我的pET-21b是从DH5a中提的,不知道会不会因为甲基化的关系没有切开?
2)如果没切开,那至少有假阳性克隆啊.但什么都没有.我想是T4 ligase的问题?

请各位不吝赐教! 我是本科生, 实验室中也没有这方面特别牛的师兄师姐.

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放了100ng质粒, 70ngPCR产物, 1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性对照, 没有问题.

1）查查相关资料，如果你认为是甲基化问题，用TOP10或JM109转转看！

2）可能是连接和转化的问题，最好先检测一下酶的活性及感受态转化效率，连接体系要注意计算载体与PCR产物的摩尔比，一般1：3，根据需要调整，PCR产物尽量多些。

幽兰君[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

兄弟们解决一下我的问题吧!! 好几天都没有人问了。我急了。
我的条带被bamhI 和 PSTI分别酶切后，出现了我的条带消失了，连T载体也被降解了。在marker的最前方有一篇亮带。体系如下：I.pstI 1 ul,10*Hbuffer1ul,DNA 1ul (2ug),ddH20 7ul. II.bamhI 1 ul,10*Kbuffer1ul,DNA 1ul (2ug),ddH20 7ul.反应温度：37度 12小时。时间是长了点可是也不能完全降解呀。我用的实验室的酶PSTI过期了4个月，BAMHI 在用的时候发现结冰了。我现在考虑的问题是1.我用的酶是不是污染了，要不我的条带怎么都降解了呢。再说了按照酶的说明书，酶的稳定性是在12小时孵育DNA是没有发生琼脂糖凝胶电泳的变化的变化的。2.我用的水不应该有问题呀，我用同样的水,酶切同样的载体＋我的片断，结果很好。条带清晰。水应该没有问题吧。3.我的酶既然结冰了，是不是有问题呀，一般他们是在甘油里面的呀。－20度是不会结冰的呀。难道我的酶失效了吗。4.再有，我小提的原液也做了对照，很好呀。

3N4G[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1) 质粒抽的不好，重新抽一次
2）先用其他的载体来检测你的酶

竹蜻蜓[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助！我用的是Takara ：BamH1和Sal1双酶切，共用buffer是1.5T，但说明书上写两种酶在T buffer中活性均小于20% 且它们还都有*活性。请问该如何是好?

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-7 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠，我想问一下，是否所有的pcr引物都需要保护碱基，引物没有保护碱基能行吗？

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