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标题:【求助】求菌液PCR的做法

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发表于 2015-12-30 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求菌液PCR的做法


我直接用牙签蘸了点菌放在PCR体系里，结果没有P出来，是什么原因啊？
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月牙牙[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用牙签从平板上挑取单菌落,放入加LB的EP管中,摇菌到一定浓度,然后在取菌液做PCR
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发表于 2015-12-30 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 月牙牙 于 2015-12-30 11:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用牙签从平板上挑取单菌落,放入加LB的EP管中,摇菌到一定浓度,然后在取菌液做PCR

摇菌到一定浓度具体指多少，假如培养基是多少毫升？
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发表于 2015-12-30 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

单菌落的挑取一般是平板的不同方向多挑几个,然后挑到1ML LB中,摇床200转,3-4个小时就OK
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发表于 2015-12-30 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那菌液用不用煮沸呢，还是直接加到PCR体系里面？
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发表于 2015-12-30 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 蒲公英 于 2015-12-30 11:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那菌液用不用煮沸呢，还是直接加到PCR体系里面？

不用煮
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发表于 2015-12-30 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.  挑取单菌落的方法;
50 ul（引物）  灭菌去离子水  34ul
  引物1()  1 ul
  引物2()  1 ul
  10×buffer  5 ul
  MgCl2  1.5 ul
  dNTP  1ul
  模板( hl-60的CDNA)  5 ul
  Taq酶（用前甩一下，且不要吸取底部物质）  0.2 ul
3min 30sec 50sec 1min 10min
94℃预变性 94℃变性 55℃退火 72℃延伸 72℃延伸
30次
将除酶以外的体系加完，同时准备5个装有1ml的LB培养基的大EP管，用消毒小枪头将单菌落挑入到体系中，煮沸10分钟（如果菌落太多会出现很多非特异性的条带）冷却10分钟后，再加入酶混合
2．菌液;一般取1ul过夜菌液，但是OD值以及用量没有规定，且无需加热
3．在作菌落PCR的时候，出现菌落的PCR呈阳性结果但是摇菌却得不到东西，所以决定先摇菌，但是如果菌液PCR也不可靠，要提取质粒DNA后再作PCR
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蒲公英[使用道具]
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 小中大
将除酶以外的体系加完，同时准备5个装有1ml的LB培养基的大EP管，用消毒小枪头将单菌落挑入到体系中.为什么要准备5个装有1ml的LB培养基的大EP管?
还有菌液是怎么准备的?
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发表于 2015-12-30 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的做法是将菌液煮了的。有时图省事，就在PCR仪上设了个96度的程序来“煮”菌。煮了有助于细菌中质粒的释放（不会是扩其他东西吧？）
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-12-30 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的菌落PCR体系就是常规的PCR体系，只是将模板用水补平。从平板上挑单斑我基本是三步，用灭菌牙签挑一下菌落后在在新的平板上划线保菌，划线的时候注意不要将培养基表面划破，随后将牙签在PCR管的反应体系中蘸几下，将牙签尖头在PCR管壁上蹭几下即可，然后将牙签扔到3ml LB液体培养基的试管中（操作过程中当然是用镊子夹取牙签了）。随后就是平板培养、液体、培养PCR同时进行。PCR的程序根常规的一样，楼上说的‘煮’没有用过，那样做结果或许能好一点吧。由PCR结果可以决定从那几根管中提质粒酶切鉴定。以上只是自己的一点体会，希望对lz能有帮助
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