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标题:酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素(一)
rmhot
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发表于 2016-1-1 22:34
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酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素(一)
关键词:国家一级标准物质 生物成分分析标准物质 食品添加剂检测 食品农药残留检测
【实验原理】
酶联免疫吸附试验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除将标准品、待测样本加入到预先包被hCG单克隆抗体(McAb)透明酶标包被板中,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分,再加入酶标工作液,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分。加入底物四甲基联苯胺(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物,在酸的作用下变成黄色,颜色的深浅与样品中人hCG浓度呈正相关,450nm波长下测定A值,根据标准品的浓度及对应的A值,可计算出样品浓度。
【试剂与仪器】
酶联免疫试剂盒测定hCG的主要试剂与仪器:
1.包被固相载体用的β-hCG亚基McAb
2.辣根过氧化物酶(HRP)标记的β-hCG亚基McAb
3.在HRP反应中作底物的TMB
4.H2SO4终止液
5.37℃恒温箱
6.标准规格酶标仪
【操作步骤】
1.样本
(1)收集晨尿,1500~2000r/min离心10分钟,取上清液待测。
(2)采血不加抗凝剂,尽快分离血清待测。
2.准备 从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡30分钟。
3.配液 用
蒸馏水
将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
4.加标准品和待测样本 取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50µl;待测样本孔中先加入待测样本10µl,再加样本稀释液40gl(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
5.温育 37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟。
6.洗板 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
7.加酶标工作液 每孔加入酶标工作液50µl,空白对照孔不加。
8.温育 37℃水浴锅或恒温箱温育30分钟。
9.洗板 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
1 0.显色 每孔先加入显色剂A液50μl,再加入显色剂B液50μl,平板混匀器混匀30秒(或用手轻轻振荡混匀30秒),37℃避光显色15分钟。
11.终止 取出酶标板,每孔加终止液50μl,终止反应(颜色由蓝色立转为黄色)。
12.测定 以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(A值)。
13.计算根据标准品的浓度及对应的A值,可计算出样品浓度。
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