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邻联大茴香胺比色法测定血清铜蓝蛋白

关键词：有证标准物质  农业部标准物质  食品安全快速检测  农药残留检测
    【实验原理】
    应用联大茴香胺二盐酸盐为底物，在铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)催化下生成淡黄棕色产物，然后加酸终止酶促反应，并生成紫红色溶液，比色测定后计算出CP酶活性。
  【试剂与仪器】
  1．醋酸盐缓冲液(pH 5．0)
  2．9．0mol/L硫酸溶液
  3．7．88mmol/L邻联大茴香胺二盐酸盐溶液
  【操作步骤】
  用1cm光径比色杯在540nm波长下，以蒸馏水调零测定吸光度值。
  【结果计算】
  CP国际单位定义：1L血清在最适pH和底物浓度下，每分钟能催化1gmol底物所需的酶量为一个国际单位。CP活性（U/L)=(A15min－A5min)/9.46×1/10×3/0.05×1000=(A15min－A5min)×6.34×102
式中A15min为15分钟管的吸光度；A5min为5分钟管的吸光度；9．46为吸光系数；10为孵育时间之差值；0．05为血清用量(m1)；3为反应液总体积(m1)。
  【参考区间】
  正常血清铜蓝蛋白为62～140U／L。
  【临床意义】
  CP是一种急性时相反应蛋白，因此在炎症、感染、肿瘤、创伤等情况下血清水平会明显升高。再生障碍性贫血、风湿病、类风湿性关节炎、甲状腺功能亢进、霍奇金病、急性精神分裂症、震颤性谵妄、高胱氨酸尿症、妊娠、口服避孕药等血清CP也会增高。此外，硅沉着病患者血清CP水平显著增高，已作为硅沉着病常规监测指标。
  CP测定主要用于肝豆状核变性(Wilson病)的诊断。此病患者血清CP活性显著降低，并伴有血清游离铜增加和尿铜排出增加。血清CP水平降低还见于肾病综合征、急性营养不良、吸收不良等引起的严重低蛋白血症，以及原发性胆汁性肝硬化、原发性胆道闭锁症、未成熟儿等。
  【注意事项】
  1．对收集后当天进行检测的血清标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。血清中CP相当稳定，2～8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70℃可保存6个月。
    2．测定过程应严格控制pH和温度。
    3．加入硫酸后应立即混匀以终止酶促反应。
    4．肝素、EDTA、草酸钾和枸橼酸盐抗凝剂对CP有抑制作用，故应以血清为测定标本，如有沉淀形成，应再次离心。
    【评价与思考】
    1．本法是基于氧化酶性质进行CP活性测定的优先选择方法，其底物和反应产物都很 稳定。但酶法测定易受干扰，在实验过程中应严格控制pH和温度等反应条件。
    2．目前测定CP的方法有邻联大茴香胺法、盐酸对苯二胺法、放射免疫法及免疫比浊法 等。邻联大茴香胺法生成的产物稳定，结果准确，但操作时间不易掌握，且其试剂价格贵，盐酸对苯二胺法操作简便，但酶反应时间较长，结果较稳定。而用免疫学方法测CP易于定量，易于标准化。