小中大之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：
下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：cuturl('http://primer3.ut.ee/')
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示
需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：
点击“Pick Primers”按钮
提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准
然后点击“Pick Primers”按钮
这样上游引物就可以使用了， 即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT
附件是上面提到的小软件，欢迎下载，该软件免费、免安装
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楼主，首先非常感谢，最近正在做血浆miRNA的定量检测，qPCR跑出来效果都不是很理想，估计与引物设计有关，请问：1.如果用你的软件设计的引物Tm值太低时，G与C的顺序与各自的数量是随便加的吗，加的怎么防止发卡结构（不是很懂）；2.如果是引物Tm值太高，加A与T各自的碱基数也是随便加的吗？也是在5'端加吗？3.前向与反向引物的GC含量一般保持在多少最合适，一定要相差很近吗？在线等您的回答，谢谢！
