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标题:【分享帖】分享

PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即使primer 3.0提示引物存在问题，照样可以扩增的
......

===============================================================================================================

非常感谢您的回复，神速啊，你的回复很有用，已经摸索一个多月了效果还是不好，有两个目的基因扩增不出来，主要原因可能还是血浆miR浓度太低，不知楼主有没有做过血浆的miR定量，有没有好的指导方法？跪谢~

555444[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即 ...

我没有做过血浆中miR

49888[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 555444 于 2016-1-5 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我没有做过血浆中miR

楼主，刚设计遇到麻烦，miR引物序列为：GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG ；由于GC含量太高，无法使Tm值降至60左右，加AT好像要加很多很多，有没有更好的办法？

PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 49888 于 2016-1-5 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，刚设计遇到麻烦，miR引物序列为：GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG ；由于GC含量太高，无法使Tm值降至60左右，加AT好像要加很多很多，有没有更好的办法？

像这个引物也没有好办法，直接用5'端的miR序列也是可以的，虽然提示TM偏高

49888[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

像这个引物也没有好办法，直接用5'端的miR序列也是可以的，虽然提示TM偏高

你意思是直接用5'端miR序列，除掉后面3'端8个碱基吗？如果是去掉后面2个暗红色碱基，直接用前面的序列，Tm值变成61了，可以这样吗？

PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 49888 于 2016-1-5 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你意思是直接用5'端miR序列，除掉后面3'端8个碱基吗？如果是去掉后面2个暗红色碱基，直接用前面的序列，Tm值变成61了，可以这样吗？

可以

3N4G[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好，正在学习你的经验，想请问你的通用下游引物是怎样确定的，看不懂，谢谢啦

PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 3N4G 于 2016-1-5 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主你好，正在学习你的经验，想请问你的通用下游引物是怎样确定的，看不懂，谢谢啦