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标题:【分享帖】分享

nut6694[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主好人，我还是不懂：1、我使用的是加A尾扩增的，出现了较多非特异扩增，就是溶解曲线效果差，加A尾这种方法进行PCR的时候是要加上下游引物的，我想问一下要是使用茎环引物是不是不需要添加下游引物？2、我使用加A尾合成第一股链cDNA的，那应该不能用茎环引物进行PCR了吧，如果我要用茎环引物进行PCR那么逆转录这一步我应该怎么办呢（比如说买哪个试剂）？
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PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nut6694 于 2016-1-5 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主好人，我还是不懂：1、我使用的是加A尾扩增的，出现了较多非特异扩增，就是溶解曲线效果差，加A尾这种方法进行PCR的时候是要加上下游引物的，我想问一下要是使用茎环引物是不是不需要添加下游引物？2、我使用加A尾合成第一股 ...

1、所有PCR都要加上下游引物；
2、不能，用茎环逆转录引物进行逆转录，用最便宜最普通的逆转录试剂即可
原理搞懂了才能分析问题，多去了解下检测原理
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发表于 2016-1-5 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，您好！谢谢您的分享！
我用了您的方法设计之后，设计>hsa-miR-155-5p MIMAT0000646
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 的引物，上游和尾加的序列重合度很高，怎么解决呢？
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ffaa[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主：请问您的引物序列是找哪家公司合成的？谢谢！！！
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PCR[使用道具]
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发表于 2016-1-5 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上海生工
逆转录引物长度较长，对合成技术要求比较高，建议找好点的公司，之前找了家本地的公司，合成效果不佳
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yizhi[使用道具]
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发表于 2016-1-5 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有一个问题想请教一下您，我使用U6做内参的，检测血浆中的miRNA表达情况，但是U6一般在26-28，（U6值在试验组之间，实验组和对照组之间，对照组之间有的甚至还相差超过3-4），请问我这个还能继续做下去吗，因为我的论文是要盲审的，所以有点害怕，希望不吝赐教。
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ffaa[使用道具]
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发表于 2016-1-5 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先很感谢楼主的分享，对于引物的设计特别有用。但是我在设计的时候有一个目的基因的序列本身就很容易配对，用您的方法改过之后，Tm可以达到要求，但是存在发卡结构，这样的情况该怎么处理呢。非常期望您能给予指导，在此先谢过。


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发表于 2016-1-5 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
左侧的cgc改成ggg试下，其实有发卡结构也没有关系，很难设计出非常完美的引物，毕竟miR序列只有25nt左右，软件只是理论上预测下，即便有发卡结构对pcr影响也不会太大，何况最后软件也告诉你了：ok 1
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nn255[使用道具]
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发表于 2016-1-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢您的回复，如此神速，已经按照您的方法设计好了引物，打算找公司合成一下看看，之前用了很多时间都没搞清楚引物设计的问题，今天终于明白啦，特别感谢楼主！
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发表于 2016-1-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我用您的软件设计的时候总是出现hairpin太高，这个应该怎么解决呢？


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